لخّصلي

يقدم النص شرحًا تفصيليًا لمعالجة الأنسجة في مختبرات علم الأمراض، بدءًا من أخذ العينات وحتى التغطية بالغطاء. يشمل ذلك وصفًا للفحص الإجمالي للعينات، مع استخدام الحبر لتحديد هوامش الأورام. يتناول النص بالتفصيل عملية التثبيت، مع شرح أنواع المثبتات المختلفة (الألدهيدات، الزئبقيون، الكحوليات، عوامل مؤكسدة، بيكرات) وآليات عملها، والعوامل المؤثرة على عملية التثبيت (التخزين المؤقت، الاختراق، المقدار، درجة الحرارة، التركيز، الفاصل الزمني)، مع ذكر استخدامات كل نوع. ثم يوضح النص عملية معالجة الأنسجة باستخدام البارافين، بما في ذلك التجفيف والتطهير والتضمين، مع ذكر البدائل البلاستيكية. يشرح النص عملية التقطيع باستخدام الميكروتوم، مع التركيز على أهمية السكين الحاد، ويشرح كيفية تحضير الأقسام المجمدة. يتناول النص بالتفصيل عملية التلوين، بما في ذلك تلوين الهيماتوكسيلين والإيوزين، بالإضافة إلى إزالة الكلس من الأنسجة. يُختتم النص بوصف القطع الأثرية التي قد تظهر في المقاطع النسيجية، مشاكل معالجة الأنسجة مثل "العوامات"، وإجراءات السلامة في المختبر، مع التركيز على التعامل الآمن مع مواد كيميائية خطرة مثل الفورمالديهايد، الزئبق، وحمض البكريك.

تقنيات الأنسجة
القائمة الرئيسية لعلم التشريح والأنسجة.

معالجة الأنسجة
يجب معالجة الأنسجة المأخوذة من الجسم لتشخيص العمليات المرضية في مختبر علم الأنسجة لإنتاج شرائح مجهرية يتم عرضها تحت المجهر بواسطة علماء الأمراض. فيما يلي وصف للتقنيات المستخدمة في معالجة الأنسجة، سواء كانت خزعات أو عينات أكبر حجمًا يتم إزالتها أثناء الجراحة أو أنسجة من تشريح الجثث. الأشخاص الذين يقومون بمعالجة الأنسجة وصنع الشرائح المجهرية الزجاجية هم خبراء في علم الأنسجة.

أخذ العينات
تحتوي عينات الأنسجة التي يتم استلامها في مختبر علم الأمراض الجراحية على نموذج طلب يسرد معلومات المريض وتاريخه بالإضافة إلى وصف لموقع المنشأ. يتم تسجيل العينات عن طريق إعطائها رقمًا يحدد كل عينة لكل مريض.

إدخال العينة.

الفحص الشامل
تصل الأنسجة التي يتم إزالتها من الجسم للتشخيص إلى قسم علم الأمراض ويتم فحصها بواسطة أخصائي علم الأمراض أو مساعد علم الأمراض أو مقيم علم الأمراض. يتكون الفحص الإجمالي من وصف العينة ووضعها كلها أو أجزاء منها في علبة بلاستيكية صغيرة تحمل الأنسجة أثناء معالجتها في كتلة البارافين. في البداية، يتم وضع العلب في مثبت.

فحص العينة الإجمالية.
فحص العينة الإجمالية.
عندما يشتبه في وجود ورم خبيث، غالبًا ما يتم تغطية العينة بالحبر لتحديد هوامش العينة. يمكن استخدام أحبار بألوان مختلفة لتحديد مناطق مختلفة إذا لزم الأمر. عند عمل المقاطع ومعالجتها، سيحدد الحبر الهامش الفعلي على الشريحة.

حبر عينة إجمالية للهوامش.

التثبيت - أنواع المثبتات
الغرض من التثبيت هو الحفاظ على الأنسجة بشكل دائم في حالة تشبه الحياة قدر الإمكان. يجب إجراء التثبيت في أقرب وقت ممكن بعد إزالة الأنسجة (في حالة الأمراض الجراحية) أو بعد الوفاة مباشرة (في حالة التشريح) لمنع التحلل الذاتي. لا يوجد مثبت مثالي، على الرغم من أن الفورمالديهايد هو الأقرب. لذلك، تتوفر مجموعة متنوعة من المثبتات للاستخدام، اعتمادًا على نوع الأنسجة الموجودة والميزات المراد إثباتها.

هناك خمس مجموعات رئيسية من المثبتات، مصنفة حسب آلية العمل:

الألدهيدات
الزئبقيون
الكحوليات
عوامل مؤكسدة
بيكراتس
تشمل الألدهيدات الفورمالديهايد (الفورمالين) والغلوتارالدهيد. يتم تثبيت الأنسجة عن طريق الروابط المتقاطعة المتكونة في البروتينات، وخاصة بين بقايا اللايسين. لا يضر هذا الارتباط المتقاطع ببنية البروتينات بشكل كبير، وبالتالي لا يتم فقدان القدرة على توليد المستضدات. لذلك، فإن الفورمالديهايد جيد لتقنيات المناعة النسيجية. يخترق الفورمالين الأنسجة جيدًا، ولكنه بطيء نسبيًا. المحلول القياسي هو الفورمالين المخزن المؤقت المحايد بنسبة 10٪. يمنع العازل الحموضة التي من شأنها أن تعزز التحلل الذاتي وتسبب ترسب صبغة الفورمول-الهيم في الأنسجة.

يسبب الغلوتارالدهيد تشوهًا في بنية الحلزون ألفا في البروتينات، لذا فهو غير مناسب للصبغ المناعي الكيميائي. ومع ذلك، فإنه يثبت بسرعة كبيرة، لذا فهو مناسب للمجهر الإلكتروني. يخترق بشكل سيئ للغاية، لكنه يعطي أفضل تفاصيل سيتوبلازمية ونواة عامة. المحلول القياسي هو غلوتارالدهيد مخزن بنسبة 2%

تثبت المواد الزئبقية الأنسجة بآلية غير معروفة. وهي تحتوي على كلوريد الزئبق وتشمل مثبتات معروفة مثل B-5 وZenker's. وتخترق هذه المثبتات الأنسجة بشكل ضعيف نسبيًا وتسبب بعض الصلابة، ولكنها سريعة وتوفر تفاصيل نووية ممتازة. وأفضل استخدام لها هو تثبيت الأنسجة المكونة للدم والأنسجة الشبكية البطانية. ولأنها تحتوي على الزئبق، فيجب التخلص منها بعناية.

إن الكحولات، بما في ذلك الكحول الميثيلي (الميثانول) والكحول الإيثيلي (الإيثانول)، هي مواد مسببة لتشويه البروتينات ولا تستخدم بشكل روتيني للأنسجة لأنها تسبب هشاشة وصلابة مفرطة. ومع ذلك، فهي جيدة جدًا لمسحات الخلايا لأنها تعمل بسرعة وتوفر تفاصيل نووية جيدة. يتم تسويق علب الرش من مثبتات الكحول للأطباء الذين يقومون بمسحات عنق الرحم، ولكن مثبتات الشعر الرخيصة تؤدي نفس الغرض.

تشمل عوامل الأكسدة مثبتات برمنجنات (برمنجنات البوتاسيوم)، ومثبتات ثنائي الكرومات (ثنائي كرومات البوتاسيوم)، ورباعي أكسيد الأوزميوم. وهي تربط البروتينات ببعضها البعض، ولكنها تسبب تحللًا واسع النطاق. وبعضها له تطبيقات متخصصة، ولكن نادرًا ما تستخدم.

تشتمل البيكرات على مثبتات تحتوي على حمض البكريك. ومن أهم هذه المثبتات محلول بوين. وهو يحتوي على آلية عمل غير معروفة. وهو يعمل بنفس كفاءة المثبتات الزئبقية ذات التفاصيل النووية ولكنه لا يسبب نفس القدر من الصلابة. وحمض البكريك يشكل خطر انفجار في شكله الجاف. وكمحلول، فإنه يصبغ كل شيء يلمسه باللون الأصفر، بما في ذلك الجلد.

التثبيت - العوامل المؤثرة على التثبيت
هناك عدد من العوامل التي تؤثر على عملية التثبيت:

التخزين المؤقت
اختراق
مقدار
درجة حرارة
تركيز
الفاصل الزمني
من الأفضل إجراء التثبيت بالقرب من درجة الحموضة المحايدة، في نطاق 6-8. يؤدي نقص الأكسجين في الأنسجة إلى خفض درجة الحموضة، لذا يجب أن تكون هناك قدرة تخزين مؤقتة في المثبت لمنع الحموضة المفرطة. تساعد الحموضة في تكوين صبغة الفورمالين الهيم التي تظهر على شكل رواسب سوداء قابلة للاستقطاب في الأنسجة. تشمل المواد العازلة الشائعة الفوسفات والبيكربونات والكاكوديلات والفيرونال. يتم تخزين الفورمالين التجاري بالفوسفات عند درجة حموضة 7.

تعتمد قدرة المادة المثبتة على الانتشار في الأنسجة على مدى قدرة كل مادة مثبتة على الانتشار، وهو أمر ثابت. حيث إن الفورمالين والكحول هما أفضل المواد المثبتة انتشارًا، في حين أن الغلوتارالدهيد هو أسوأها انتشارًا. أما الزئبق وغيره من المواد المثبتة فتقع في مكان ما بين الاثنين. ومن الطرق التي يمكن بها التغلب على هذه المشكلة تقسيم الأنسجة إلى شرائح رقيقة (2 إلى 3 مم). حيث يحدث الاختراق في الشريحة الرقيقة بشكل أسرع من اختراق الشريحة السميكة.

حجم المثبت مهم. يجب أن تكون نسبة المثبت إلى الأنسجة 10:1. من الواضح أننا غالبًا ما ننجح في الحصول على كمية أقل من هذا، ولكن قد لا نحصل على تثبيت مثالي. إحدى الطرق لحل المشكلة جزئيًا هي تغيير المثبت على فترات لتجنب استنفاد المثبت. كما أن تحريك العينة في المثبت سيعزز التثبيت.

إن زيادة درجة الحرارة، كما هو الحال مع جميع التفاعلات الكيميائية، من شأنها أن تزيد من سرعة التثبيت، طالما أنك لا تقوم بطهي الأنسجة. يعمل الفورمالين الساخن على تثبيت الأنسجة بشكل أسرع، وغالبًا ما تكون هذه هي الخطوة الأولى في معالج الأنسجة الآلي.

يجب ضبط تركيز المثبت إلى أدنى مستوى ممكن، لأنك ستنفق أموالاً أقل على المثبت. يكون تركيز الفورمالين أفضل بنسبة 10%؛ وعادة ما يتكون الغلوتارالدهيد بنسبة تتراوح من 0.25% إلى 4%. قد يؤثر التركيز المرتفع للغاية سلبًا على الأنسجة وينتج آثارًا تشبه الحرارة الزائدة.

كما أن الفترة الزمنية بين إزالة الأنسجة وتثبيتها مهمة جدًا. فكلما أسرعت في الحصول على الأنسجة وتثبيتها، كان ذلك أفضل. وسوف يتم إدخال الأنسجة الصناعية عن طريق التجفيف، لذا إذا تركت الأنسجة، يرجى الحفاظ عليها رطبة باستخدام محلول ملحي. وكلما طالت مدة الانتظار، كلما فقدت المزيد من العضيات الخلوية وزاد الانكماش النووي والتكتل الصناعي.

المثبتات - الاستخدام العام
هناك استخدامات شائعة للمثبتات في مختبر علم الأمراض تعتمد على طبيعة المثبتات ونوع الأنسجة والتفاصيل النسيجية التي يجب إثباتها.

يستخدم الفورمالين في جميع أنواع الأنسجة الجراحية الروتينية والتشريحية عندما يتم إنتاج شريحة H وE. الفورمالين هو الأكثر تسامحًا من بين جميع المواد المثبتة عندما لا تكون الظروف مثالية، ولا يوجد نسيج قد يضره بشكل كبير. يمكن لمعظم الأطباء والممرضات فهم ماهية الفورمالين ووظيفته ورائحته الكريهة بما يكفي لجعلهم يتعاملون معه بحذر.

يوصى باستخدام مثبتات زينكر للأنسجة الشبكية البطانية بما في ذلك العقد الليمفاوية والطحال والغدة الزعترية ونخاع العظم. تعمل مثبتات زينكر على تثبيت النوى بشكل جيد للغاية وتعطي تفاصيل جيدة. ومع ذلك، يجب إزالة رواسب الزئبق (إزالة الزئبق) قبل التلوين وإلا فإن الرواسب السوداء ستؤدي إلى ظهور المقاطع.

يُنصح أحيانًا باستخدام محلول بوين لتثبيت الخصيتين والجهاز الهضمي والأنسجة الصماء. كما أنه لا يؤدي وظيفته بشكل سيئ على الأنسجة المكونة للدم، ولا يتطلب إزالة الصبغة قبل التلوين.

يوصى باستخدام الغلوتارالدهيد لتثبيت الأنسجة في المجهر الإلكتروني. يجب أن يكون الغلوتارالدهيد باردًا ومخزنًا مؤقتًا ولا يزيد عمره عن 3 أشهر. يجب أن تكون الأنسجة حديثة قدر الإمكان ويفضل أن يتم تقسيمها داخل الغلوتارالدهيد بسمك لا يزيد عن 1 مم لتعزيز التثبيت.

تُستخدم الكحولات، وخاصة الإيثانول، بشكل أساسي في اللطاخات الخلوية. الإيثانول (95%) سريع ورخيص. ونظرًا لأن اللطاخات تتكون من خلية واحدة أو نحو ذلك من السُمك، فلا توجد مشكلة كبيرة من الانكماش، ونظرًا لأن اللطاخات غير مقسمة، فلا توجد مشكلة من الهشاشة المستحثة.

لإصلاح الأقسام المجمدة، يمكنك استخدام أي شيء تقريبًا - على الرغم من أن الميثانول والإيثانول هما الأفضل.

معالجة الأنسجة
بمجرد تثبيت الأنسجة، يجب معالجتها في شكل يمكن تحويلها فيه إلى أقسام مجهرية رقيقة. الطريقة المعتادة للقيام بذلك هي باستخدام البارافين. يمكن تقطيع الأنسجة المغروسة في البارافين، والتي تشبه الأنسجة في كثافتها، إلى أي قسم من 3 إلى 10 ميكرون، وعادة ما يكون 6-8 ميكرون بشكل روتيني. تسمى تقنية تثبيت الأنسجة في البارافين بمعالجة الأنسجة. الخطوات الرئيسية في هذه العملية هي التجفيف والتطهير.

لا يمكن ترشيح الأنسجة المبللة الثابتة (في المحاليل المائية) مباشرة باستخدام البارافين. أولاً، يجب إزالة الماء من الأنسجة عن طريق التجفيف. يتم ذلك عادةً باستخدام سلسلة من الكحولات، على سبيل المثال 70% إلى 95% إلى 100%. في بعض الأحيان تكون الخطوة الأولى عبارة عن مزيج من الفورمالين والكحول. يمكن استخدام مواد تجفيف أخرى، لكن لها عيوب كبيرة. الأسيتون سريع جدًا، لكنه يشكل خطر حريق، لذا فهو آمن فقط للمجموعات الصغيرة من الأنسجة المعالجة يدويًا. يمكن استخدام الديوكسان بدون تنقية، لكنه يحتوي على أبخرة سامة.

الخطوة التالية تسمى "التطهير" وتتكون من إزالة المادة المجففة بمادة قابلة للامتزاج مع وسط التضمين (البارافين). وأكثر مواد التطهير شيوعًا هو الزيلين. يعمل التولوين جيدًا، وهو أكثر تحملاً لكميات صغيرة من الماء المتروكة في الأنسجة، ولكنه أغلى بثلاث مرات من الزيلين. كان الكلوروفورم يستخدم في السابق، ولكنه يشكل خطرًا على الصحة، كما أنه بطيء. نادرًا ما يتم استخدام ساليسيلات الميثيل لأنه باهظ الثمن، ولكنه ذو رائحة طيبة (إنه زيت شتوي أخضر).

تتوفر عوامل تنظيف أحدث للاستخدام. يعتمد العديد منها على الليمولين، وهو زيت متطاير يوجد في قشور الحمضيات. ويستخدم عامل آخر الهيدروكربونات الأليفاتية طويلة السلسلة (كليريت). وعلى الرغم من أنها تمثل خطرًا أقل على الصحة، إلا أنها أقل تسامحًا مع الأنسجة غير المثبتة جيدًا أو المجففة أو المقسمة.

أخيرًا، يتم غمر الأنسجة بعامل التضمين، وهو في الغالب البارافين. يمكن شراء البارافينات التي تختلف في نقطة الانصهار، وفقًا لدرجات الصلابة المختلفة، اعتمادًا على الطريقة التي يفضلها بها أخصائي تقنية الأنسجة وعلى المناخ (دافئ مقابل بارد). يحتوي منتج يسمى بارابلاست على مواد ملينة مضافة تجعل قطع كتل البارافين أسهل بالنسبة لبعض الفنيين. يمكن تطبيق الفراغ داخل معالج الأنسجة للمساعدة في اختراق عامل التضمين.

إن العمليات المذكورة أعلاه تتم بشكل آلي تقريباً في أغلب الأحيان بالنسبة للكميات الكبيرة من الأنسجة التي تتم معالجتها بشكل روتيني. وتتكون الأتمتة من أداة تحرك الأنسجة من خلال العوامل المختلفة على مقياس زمني محدد مسبقاً. إن معالج الأنسجة "التقني" هو أحد أكثر المعالجات شيوعاً وموثوقية (وهو معالج ميكانيكي مزود بمحرك كهربائي يحرك التروس والكامات)، على الرغم من أنه لم يعد يُصنع. وتحتوي المعالجات الأحدث على أجهزة كمبيوتر، وليس عجلات كامات، للتحكم فيها، كما تحتوي على آبار كواشف محكمة الغلق يمكن تطبيق الفراغ و/أو الحرارة عليها.

معالج الأنسجة.
معالج الأنسجة الآلي.
تظل الأنسجة التي تخرج من معالج الأنسجة في الكاسيتات ويجب وضعها يدويًا في الكتل بواسطة فني يجب عليه أن يلتقط الأنسجة من الكاسيت ويسكب البارافين المنصهر فوقها. تعد عملية "التضمين" هذه مهمة للغاية، لأن الأنسجة يجب أن تكون محاذية أو موجهة بشكل صحيح في كتلة البارافين.

تضمين الأنسجة.
تضمين الأنسجة.
تتضمن البدائل للتغليف بالبارافين أنواعًا مختلفة من البلاستيك تسمح بأجزاء أرق. وتشمل هذه البلاستيكات ميثاكريلات الميثيل، وميثاكريلات الجليكول، والأرالديت، والإيبون. ميثاكريلات الميثيل صلبة جدًا وبالتالي فهي جيدة لتغليف العظام غير المتكلسة. ميثاكريلات الجليكول هي الأكثر استخدامًا لأنها الأسهل في التعامل معها. الأرالديت يشبه الميثاكريلات تقريبًا، لكنه يتطلب عملية تغليف أكثر تعقيدًا. يستخدم الإيبون بشكل روتيني في المجهر الإلكتروني حيث تكون هناك حاجة إلى أجزاء رقيقة جدًا.

تتطلب المواد البلاستيكية مواد كيميائية خاصة لإزالة الماء والتطهير، وهي مواد باهظة الثمن. ولهذا السبب، ولأن الأنسجة التي تحتوي على البلاستيك قليلة، فإن المعالجة تتم عادة باليد. ويتطلب الأمر استخدام ميكروتوم خاص لتقطيع هذه الكتل. ويجب صنع كتل صغيرة، وبالتالي فإن هذه التقنية مناسبة لأخذ عينات صغيرة من أنسجة مثل نخاع العظام أو الكبد.

التقطيع
بمجرد غرس الأنسجة، يجب تقطيعها إلى أقسام يمكن وضعها على شريحة. يتم ذلك باستخدام ميكروتوم. الميكروتوم ليس أكثر من سكين بآلية لدفع كتلة البارافين لمسافات قياسية عبرها. هناك ثلاث ضروريات مهمة للتقطيع السليم: (1) سكين حاد للغاية، (2) سكين حاد للغاية، و(3) سكين حاد للغاية.

التقطيع باستخدام الميكروتوم.
فيلم MPEG [672 كيلو بايت] يوضح تقنية التقطيع باستخدام الميكروتوم.
السكاكين إما أن تكون من النوع المعدني السميك القياسي أو من النوع الرقيق القابل للاستخدام مرة واحدة (مثل شفرة الحلاقة التي تستخدم لمرة واحدة). يسمح النوع الأول بالشحذ حسب الطلب حسب رغبة الشخص، ولكنه مكلف (أكثر من 100 دولار للشفرة الواحدة). يكلف النوع الأخير حوالي دولار واحد للشفرة وهو جيد تقريبًا بنفس الدرجة. تصبح ميزة الشفرة التي تستخدم لمرة واحدة واضحة عند تقطيع كتلة مخفية فيها سلك معدني أو خيوط جراحية.

يتم تقطيع الكتل البلاستيكية (الميثاكريلات أو الأرالديت أو الإيبون) باستخدام سكاكين زجاجية أو ماسية. يمكن لسكين الزجاج أن يقطع حتى حوالي 1 ميكرون. من الأفضل أن يتم تقطيع المقاطع الرقيقة للمجهر الإلكتروني (1/4 ميكرون) باستخدام سكين الماس وهو باهظ الثمن للغاية (2500 دولار).

تحتوي الميكروتومات على آلية لتمرير الكتلة عبر السكين. وعادة ما يمكن ضبط هذه المسافة، بالنسبة لمعظم الأنسجة المضمنة بالبارافين، عند 6 إلى 8 ميكرون. وكلما كان الميكروتوم أغلى (15000 إلى 30000 دولار)، كانت هذه الآلية أفضل وأطول عمرًا.

إن تقطيع الأنسجة فن حقيقي ويتطلب الكثير من المهارة والممارسة. إن خبراء تكنولوجيا الأنسجة هم فنانو المختبر. ومن المهم أن يكون لديك كتلة مثبتة ومضمنة بشكل صحيح وإلا يمكن إدخال الكثير من الأشياء في عملية التقطيع. وتشمل الأشياء الشائعة التمزق والانشقاق و"الستائر الفينيسية" والثقوب والطي وما إلى ذلك. وبمجرد قطع الأقسام، يتم تعويمها في حمام ماء دافئ يساعد في إزالة التجاعيد. ثم يتم التقاطها على شريحة مجهرية زجاجية.

التقاط الأقسام من حمام الماء.
قسم غير ملطخ على شريحة زجاجية.
ثم توضع الشرائح الزجاجية في فرن دافئ لمدة 15 دقيقة تقريبًا لمساعدة القسم على الالتصاق بالشريحة. وإذا كانت هذه الحرارة قد تضر بأشياء مثل المستضدات المستخدمة في التلوين المناعي، فيمكن تجاوز هذه الخطوة واستخدام شرائح مطلية بالغراء بدلاً من ذلك لالتقاط الأقسام.

صينية الشرائح غير الملطخة في فرن التجفيف.
الأقسام المجمدة
في بعض الأحيان أثناء إجراء العمليات الجراحية، من الضروري الحصول على تشخيص سريع لعملية مرضية. قد يرغب الجراح في معرفة ما إذا كانت هوامش استئصاله للورم الخبيث واضحة قبل الإغلاق، أو قد يتم العثور على عملية مرضية غير متوقعة وتتطلب التشخيص لتحديد ما يجب فعله بعد ذلك، أو قد يكون من الضروري تحديد ما إذا كان قد تم الحصول على الأنسجة المناسبة لمزيد من الفحص لعملية مرضية. يتم تحقيق ذلك من خلال استخدام مقطع مجمد. يتم تجميد قطعة (قطع) الأنسجة المراد دراستها في سائل بارد أو بيئة باردة (-20 إلى -70 درجة مئوية). يجعل التجميد الأنسجة صلبة بما يكفي لتقطيعها باستخدام ميكروتوم.

يتم إجراء المقاطع المجمدة باستخدام أداة تسمى جهاز التبريد. جهاز التبريد هو عبارة عن صندوق مبرد يحتوي على ميكروتوم. تتراوح درجة الحرارة داخل جهاز التبريد بين -20 إلى -30 درجة مئوية. يتم قطع المقاطع النسيجية وتقطيعها على شريحة زجاجية. ثم تصبح المقاطع جاهزة للتلوين.

قطع الجزء المجمد.

تلطيخ
يجب عكس عملية التضمين من أجل إخراج شمع البارافين من الأنسجة والسماح للأصباغ القابلة للذوبان في الماء بالتغلغل في الأقسام. لذلك، قبل القيام بأي تلطيخ، يتم "إزالة البارافين" من الشرائح عن طريق تمريرها عبر الزيلين (أو البدائل) إلى الكحولات إلى الماء. لا يمكن عمل أي تلطيخ على الأنسجة المحتوية على البارافين.

تستخدم عملية التلوين مجموعة متنوعة من الأصباغ التي تم اختيارها لقدرتها على تلوين المكونات الخلوية المختلفة للأنسجة. التلوين الروتيني هو تلوين الهيماتوكسيلين والتآكل (H و E). يشار إلى البقع الأخرى باسم "البقع الخاصة" لأنها تستخدم في مواقف محددة وفقًا للحاجة التشخيصية.

شرائح يتم صبغها على جهاز الصبغ الآلي.
شرائح يتم صبغها على جهاز الصبغ الآلي.
يتم صبغ الأقسام المجمدة يدويًا، لأن هذا أسرع لقسم واحد أو عدة أقسام فردية. الصبغة عبارة عن صبغة "تقدمية" حيث يتم ترك القسم على اتصال بالصبغة حتى يتم الحصول على اللون المطلوب.

تلوين قسم مجمد.
صبغ H و E
الهيماتوكسيلين هو المنتج المؤكسد لشجرة الخشب المعروفة باسم الهيماتين. ونظرًا لأن هذه الشجرة نادرة جدًا في الوقت الحاضر، فإن معظم الهيماتين من النوع الصناعي. ولاستخدامه كصبغة، يجب "نضجه" أو تأكسدته. ويمكن القيام بذلك بشكل طبيعي عن طريق وضع محلول الهيماتين على الرف والانتظار لعدة أشهر، أو عن طريق شراء الهيماتين الناضج تجاريًا أو عن طريق وضع عوامل النضج في محلول الهيماتين.

لا يصبغ الهيماتوكسيلين الأنسجة بشكل مباشر، ولكنه يحتاج إلى "مادة رابطة" أو رابط بالأنسجة. ويتم ذلك عن طريق كاتيون معدني مثل الحديد أو الألومنيوم أو التنجستن. ويعتمد تنوع الهيماتوكسيلينات المتاحة للاستخدام جزئيًا على اختيار أيون المعدن المستخدم. وتختلف في شدتها أو لونها. ولأن الهيماتوكسيلين صبغة أساسية، فإنه يتمتع بتقارب مع الأحماض النووية لنواة الخلية.

إن بقع الهيماتوكسيلين إما أن تكون "ارتدادية" أو "تقدمية". ففي البقعة الارتدادية، تُترك الشرائح في المحلول لفترة زمنية محددة ثم تُمرر مرة أخرى عبر محلول مثل الكحول الحمضي الذي يزيل جزءًا من البقعة. وتعمل هذه الطريقة بشكل أفضل مع دفعات كبيرة من الشرائح المراد صبغها ويمكن التنبؤ بها بشكل أكبر على أساس يومي. وفي البقعة التقدمية، تُغمس الشريحة في الهيماتوكسيلين حتى يتم تحقيق كثافة الصبغة المطلوبة، كما هو الحال مع القسم المجمد. وهذه الطريقة بسيطة لشريحة واحدة، ولكنها غير مناسبة للمعالجة على دفعات.

الإيوزين هو صبغة حمضية لها تقارب مع المكونات السيتوبلازمية للخلية. هناك مجموعة متنوعة من الإيوزينات التي يمكن تصنيعها للاستخدام، وتختلف في لونها، لكنها جميعًا تعمل بنفس الطريقة تقريبًا. الإيوزين أكثر تسامحًا من الهيماتوكسيلين وأقل مشكلة في المختبر. المشكلة الوحيدة التي ستراها هي الإفراط في التلطيخ، وخاصة مع الأنسجة الخالية من الكالسيوم.

تغطية بالغطاء
يجب تغطية الجزء الملطخ من الشريحة بقطعة رقيقة من البلاستيك أو الزجاج لحماية الأنسجة من الخدش، ولتوفير جودة بصرية أفضل للعرض تحت المجهر، وللحفاظ على جزء الأنسجة لسنوات قادمة. يجب أن تمر الشريحة الملطخة بالعملية العكسية التي مرت بها من جزء البارافين إلى الماء. يتم تمرير الشريحة الملطخة عبر سلسلة من محاليل الكحول لإزالة الماء، ثم من خلال عوامل التصفية إلى النقطة التي يمكن عندها وضع مادة راتنجية دائمة أسفل الغطاء الزجاجي، أو فيلم بلاستيكي، فوق الجزء.

غطاء انزلاقي.
غطاء انزلاقي.

إزالة الكلس
تحتوي بعض الأنسجة على رواسب كالسيوم شديدة الصلابة ولا يمكن تقطيعها بشكل صحيح باستخدام البارافين بسبب الاختلاف في الكثافة بين الكالسيوم والبارفين. عينات العظام هي النوع الأكثر احتمالاً هنا، ولكن قد تحتوي أنسجة أخرى أيضًا على مناطق متكلسة. يجب إزالة الكالسيوم قبل التضمين للسماح بالتقطيع. تم استخدام مجموعة متنوعة من العوامل أو التقنيات لإزالة الكلس من الأنسجة ولا يعمل أي منها بشكل مثالي. تم استخدام الأحماض المعدنية والأحماض العضوية وEDTA والتحليل الكهربائي.

تُستخدم الأحماض المعدنية القوية مثل حمض النيتريك وحمض الهيدروكلوريك مع العظام القشرية الكثيفة لأنها تزيل كميات كبيرة من الكالسيوم بمعدل سريع. ومن المؤسف أن هذه الأحماض القوية تلحق الضرر أيضًا بمورفولوجيا الخلايا، لذا لا يُنصح باستخدامها للأنسجة الحساسة مثل نخاع العظام.

الأحماض العضوية مثل حمض الأسيتيك وحمض الفورميك أكثر ملاءمة لنخاع العظام، لأنها ليست قاسية بنفس القدر. ومع ذلك، فهي تعمل بشكل أبطأ على العظام القشرية الكثيفة. حمض الفورميك بتركيز 10% هو أفضل مزيل للكالسيوم. تتوفر بعض الحلول التجارية التي تجمع بين حمض الفورميك والفورمالين لتثبيت الأنسجة وإزالة الكالسيوم منها في نفس الوقت.

يمكن لـ EDTA إزالة الكالسيوم وهو ليس قاسيًا (ليس حمضًا) ولكنه يخترق الأنسجة بشكل سيئ ويعمل ببطء وهو مكلف بكميات كبيرة.

لقد تم تجربة التحليل الكهربائي في مواقف تجريبية حيث كان من الضروري إزالة الكالسيوم بأقل قدر من الضرر للأنسجة. إنه بطيء وغير مناسب للاستخدام اليومي الروتيني.

القطع الأثرية في المقاطع النسيجية
قد تظهر مجموعة من القطع الأثرية في الشرائح الملطخة نتيجة للتثبيت غير السليم، أو نوع المثبت، أو الجفاف السيئ وتسرب البارافين، أو الكواشف غير المناسبة، أو تقطيع الميكروتوم السيئ.

يشير وجود راسب أسود ناعم على الشرائح، غالبًا لا علاقة له بالأنسجة (أي أن الراسب يظهر بجوار الأنسجة أو داخل الفجوات أو الأوعية) إلى تكون صبغة الفورمالين-الهيم. يمكن تأكيد ذلك من خلال المجهر الضوئي المستقطب، لأن هذه الصبغة ستستقطب لونًا أبيض ساطعًا (وستبدو الشريحة مثل العديد من النجوم في السماء). غالبًا ما تُرى صبغة الفورمالين-الهيم في الأنسجة شديدة الخلايا أو الدموية، أو في أنسجة التشريح، لأن هذه الصبغة تتشكل عندما ينفد محلول الفورمالين وتصبح الأنسجة حمضية، مما يعزز تكوين مركب من الهيم (من خلايا الدم الحمراء) والفورمالين. الأنسجة مثل الطحال والعقد الليمفاوية معرضة بشكل خاص لهذا التلف. سيساعد عمل أقسام رقيقة واستخدام كمية كافية من الفورمالين المخزن المؤقت المحايد (نسبة 10 إلى 1 من المثبت إلى الأنسجة). إذا كان محلول المثبت الذي توضع فيه الأنسجة بنيًا داكنًا إلى أحمر، فضع الأنسجة في مثبت جديد.

يشير وجود كتل كبيرة غير منتظمة من الرواسب السوداء على شرائح الأنسجة المثبتة في مثبت زئبقي مثل B-5 إلى أن الأنسجة لم تخضع لعملية "إزالة الكرياتينين" قبل التلوين. ستظهر هذه الرواسب السوداء أيضًا باللون الأبيض باستخدام المجهر الضوئي المستقطب.

إن الأنسجة التي لم يتم تجفيفها بشكل كافٍ قبل التصفية والتسرب باستخدام شمع البارافين سوف يكون من الصعب تقطيعها على الميكروتوم، مع وجود آثار تمزق وثقوب في الأقسام. يجب أن تسمح دورات معالجة الأنسجة بوقت كافٍ للتجفيف، ويجب أن يكون محلول الإيثانول المجفف النهائي بتركيز 100%. في المناخات الرطبة، من الصعب تحقيق ذلك. سيساعد تغطية أو سد المحاليل من الهواء المحيط. كما أن تكييف الهواء (باستخدام المبردات، وليس المبردات التبخيرية) سيقلل من الرطوبة في المختبر. التولوين كعامل تصفية أكثر تسامحًا مع الأنسجة التي تم تجفيفها بشكل سيئ، لكنه أكثر تكلفة ويشكل خطرًا صحيًا أكبر من عوامل التصفية الأخرى غير الزيلينية

على الرغم من أن الكحولات مثل الإيثانول تعد مثبتات ممتازة للطاخات الخلوية، إلا أنها تميل إلى جعل أقسام الأنسجة هشة، مما يؤدي إلى ظهور آثار تقطيع المجهر مع الثرثرة ومظهر "الستارة البندقية".

قد تتكون فقاعات أسفل الغطاء الزجاجي عندما تكون مادة التركيب رقيقة للغاية، ومع جفافها يتم امتصاص الهواء أسفل الغطاء الزجاجي. كما قد يؤدي تلوث عوامل التنظيف أو مواد الغطاء الزجاجي إلى ظهور فقاعات تحت المجهر.

قطعة أثرية تحتوي على أنسجة غير زنكرية.

مشاكل في معالجة الأنسجة
"العوامات" عبارة عن قطع صغيرة من الأنسجة تظهر على الشريحة ولا تنتمي إلى هذه الشريحة، فقد طفت أثناء المعالجة. وقد تنشأ العوامات نتيجة لإجراء غير دقيق على طاولة القطع، فقد تحمل المناشف أو الأدوات أو القفازات المتسخة أنسجة تنتقل إلى الحالة التالية. لذلك، من الضروري أن تقوم بأخذ عينة واحدة فقط في كل مرة وتنظيفها جيدًا قبل فتح حاوية الحالة التالية.

أفضل طريقة للحماية من الأجسام العائمة غير المعروفة هي فصل العينات المتشابهة دائمًا حسب تسلسل الترقيم. على سبيل المثال، إذا كان لديك ثلاث حالات بها شرائح من البروستاتا، فافصلها عن بعضها البعض باستخدام عينات مختلفة تمامًا مثل الرحم أو المعدة. بهذه الطريقة، إذا تم تبديل الأرقام أو كتابة العلامات بشكل خاطئ أو نقل الأنسجة، فسيكون لديك عدم تطابق واضح. قد لا يتم التعرف على نقل البروستاتا إلى أخرى، أو نقل أعداد الأنسجة المتطابقة أبدًا.

إذا تم استخدام أشرطة قابلة لإعادة الاستخدام، فيجب أن تكون على دراية بأن الأنسجة قد تنتقل وتظهر على شكل "عوامات" حتى بعد عدة أيام، عندما يتم إعادة استخدام الشريط. تنشأ المشكلة عندما لا تتم إزالة كل الأنسجة من الشريط أثناء التضمين. ثم أثناء عملية التنظيف، لا تتم إزالة كل الشمع. ثم لا ينتبه الشخص التالي الذي يستخدم الشريط إلى حقيقة وجود أنسجة بالفعل في الشريط ويضع عينة فيه. ستبدو العوامة التي تظهر على الشريحة محفوظة جيدًا - يجب أن تكون كذلك، لأنها تمت معالجتها بالبارافين.

تأكد دائمًا من تحديد الأنسجة بشكل صحيح! وهذا يعني التأكد من أن ملصق المريض الموجود على حاوية العينة يتطابق مع ملصق الطلب. يتم إعطاء رقم تسجيل للعينة. يجب أن يظهر هذا الرقم مع الأنسجة في جميع الأوقات. يجب ألا تقدم أبدًا شريطًا من الأنسجة بدون ملصق. يجب ألا تقدم أبدًا شريطًا من الأنسجة بملصق خاطئ. إن وضع علامات خاطئة أو عدم وضع علامات على الأنسجة يؤدي إلى كارثة.

السلامة في المختبر
يجب أن يكون المختبر جيد التهوية. هناك لوائح تحكم الفورمالين والهيدروكربونات مثل الزيلين والتولوين. هناك حدود وضعتها إدارة السلامة والصحة المهنية (OSHA) لا ينبغي تجاوزها. وقد تم تعديل هذه الحدود مؤخرًا إلى مستويات مخفضة.

يجب أن يكون لكل مركب كيميائي يستخدم في المختبر ورقة بيانات سلامة المواد في الملف والتي تحدد طبيعة المركب وسميته واحتياطات السلامة التي يجب اتخاذها عند التعامل معه.

يجب أن يكون لدى المختبر طريقة للتخلص من النفايات الخطرة. غالبًا ما تتعاقد مرافق الرعاية الصحية التي تعالج الأنسجة مع شركة لإدارة النفايات. يجب تخزين الأنسجة التي يتم جمعها في الفورمالين ويمكن التخلص منها عن طريق حرقها أو وضعها في "مطحنة الأنسجة" المرفقة بحوض كبير (مشابه لوحدة التخلص من القمامة الكبيرة).

يجب أن تتوافق كل أداة مستخدمة في المختبر مع مواصفات السلامة الكهربائية (أن تكون معتمدة من UL) وأن تحتوي على تعليمات مكتوبة بخصوص استخدامها.

لا يجوز تخزين المواد القابلة للاشتعال إلا في غرف معتمدة وفي خزانات تخزين مصممة لهذا الغرض فقط.

يجب نشر إجراءات السلامة من الحرائق. ويجب أن تكون معدات السلامة بما في ذلك طفايات الحريق وبطانيات الحريق وأجهزة الإنذار من الحرائق في متناول اليد. ويجب أن يكون الدش وغسول العيون متاحين بسهولة.

يجب توثيق الحوادث المعملية والتحقيق فيها من خلال تقارير الحوادث وتقارير الحوادث الصناعية.

تتضمن المخاطر المحددة التي يجب أن تعرفها ما يلي:

يتم تصنيع محلول بوين باستخدام حمض البكريك. هذا الحمض يباع فقط في الحالة المائية. عندما يجف، يصبح قابلاً للانفجار.

تحتوي العديد من مجموعات الكواشف على أزيد الصوديوم كمادة حافظة. من المفترض أن تتخلص من المحاليل التي تحتوي على أزيد الصوديوم في البالوعة بالكثير من الماء، وإلا فهناك ميل لأن يشكل الأزيد أزيدات معدنية في السباكة. كما أنها قابلة للانفجار.

المركبات التي تحتوي على البنزيدين والبنزين والأنثراسين والنافتول هي مواد مسببة للسرطان ويجب عدم استخدامها.

يجب دائمًا التخلص من المحاليل المحتوية على الزئبق (زنكر أو بي 5) في حاويات مناسبة. إذا سُكِب الزئبق في البالوعة، فسوف يتشكل ملغم مع المعدن الذي يتراكم ولا يمكن