Culture cellulaire..................CONSERVATION DES LIGNEES CELLULAIRES 3.1) Conservation par le froid Les cellules peuvent etre conservees en azote liquide (-196 ?C) pendant de longues periodes, a condition d'avoir ete correctement congelees et dans une solution cryoprotectrice appropriee (le DMSO) 3.2) Conservation sur milieu pauvre : c'est une conservation de courte duree (10 a 20 jours) realisee sur des milieux pauvre en serum et/ou en baissant la temperature de la culture a 20 ?C.16
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4.4) - Les milieux de culture On distingue 2 principaux types de milieux de culture : a) les milieux semi-synthetiques : composes d'un milieu de base (sels mineraux, glucose, acides amines, vitamines) tel que (BME : Eagle's Basal Medium, MEM : Eagle's Minimum Essential Medium, DMEM : Dulbecco Modified Eagle's Medium et le RPMI) et du serum (a 10%) ?le serum : le plus utilise est le serum de veau foetal (SVF) il optimise la survie et la croissance cellulaire en apportant les facteurs suivant : facteurs de croissance (FGF, les NGF, IGF, EGF les PDGF), proteines d'adhesion, proteines de transport, oligo-elements.oLe repiquage ou passage : Il s'agit cette fois de changer le milieu et le contenant, en transferant les cellules confluentes dans un contenant plus grand : d'abord elimination de l'ancien milieu par aspiration, lavage des cellules au PBS, decollement des cellules par trypsine-EDTA o ajout de milieu complet avec SVF : permet de remettre les cellules en suspension ; o numeration cellulaire : via le test de viabilite cellulaire (utilisant le bleu de trypan) afin de determiner la concentration cellulaire et d'additionner une quantite definie de cellules dans un volume defini de milieu, sur une surface definie.De repiquage en repiquage, les monocouches cellulaires sont lavees avec un tampon PBS puis traitees par une solution de trypsine- EDTA afin de rompre les liaisons proteiques intercellulaires et obtenir une suspension prete a etre ensemencees sur des milieux nutritifs neufs et avec une densite moindre a- Lignees cellulaires : * les lignees finies : qui se proliferent pendant un certains nombres de passages puis cessent de se diviser.Generalement, le tissu primaire est decoupe en fragments de 1 a 4 mm puis incorpores dans un flacon de culture contenant le milieu nutritif et apres jours, on observe une migration cellulaire a partir des differents fragments tissulaires puis une proliferation de ces dernieres.(Fig 2) Pour les tissus mous (thymus, rate,..), la methode mecanique est la plus adoptee elle effectuee par dilaceration des tissus primaires a l'aide d'une pipette ou encore par frottement du tissu sur une grille.Le mode d'obtention de ces cellules repond a deux methodes principales citant la mecanique et l'enzymatique Methodes d'obtention des cellules ?Methode de dissection mecanique (methode d'explant): c'est la plus ancienne, elle englobe differents protocoles (La methode de Carrel, La methode de Jensen et La methode de dissection sensu stricto) , ayant comme principe la migration des cellules a partir d'un explant (fragment).4.3) Equipement de la salle de culture : l'elaboration de cultures cellulaires necessite le materiel suivant : (Fig 4) a) Une hotte a flux laminaire :
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steriles en generant un flux d'air purifie via un filtre HEPA (High Efficiency Particulate Air), afin d'eviter toute contamination de l'environnement, de l'utilisateur et/ou de la manipulation.11
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Fig 1(A) : Culture stationnaire Fig 1(B) : Culture en suspension 2.3)- le stade de culture selon ce critere il existe trois principaux types de cultures : a- Cultures primaires ou primoculture : c'est l'inoculation aseptique de cellules provenant directement d'un organe ou d'un tissu.* les lignees continues : Ces lignees proliferent sans arret, et sont donc immortelles ; car elles ont perdu quelques maillons du controle du cycle cellulaire * les lignees transformees : Certaines lignees continues peuvent perdre leur propriete d'adherence et sont capables de donner des tumeurs lorsqu'elles sont injectees chez un animal.Elle consiste a utiliser des enzymes proteolytiques telles que la trypsine, la collagenase, la hyaluronidase pour digerer la trame proteique et permettant ainsi la liberation des cellules.Il en resulte une suspension de
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cellules individuelles pretes a etre mises en primoculture.EVOLUTION D'UNE CULTURE CELLULAIRE (la Courbe de croissance) Elle est caracterisee par 3 temps : -La phase d'adaptation : c'est la phase de latence pendant laquelle la vitesse de croissance est nulle -La phase exponentielle : correspond a phase mitotique ou le un taux de croissance augmente jusqu'a devenir constant.APPLICATIONS DE LA CULTURE DES CELLULES ANIMALES physiologiques (recherche fondamentale ou appliquee) a Test de cytotoxicite en pharmacologie ou cosmetologie par exemple terferons, interleukines, facteurs de croissance, anticorps monoclonaux ...) appliquee) a Chirurgie reparatrice (peau, muscle, foie, vaisseaux sanguins, ....INTRODUCTION : Une culture de cellules est un bioprocede permettant de maintenir en dehors de l'organisme et dans des conditions physiologiques artificielles, des cellules non organisees en tissu mais
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capable de se proliferer in vitro.Fig 1(A, B) a- Culture en monocouche ou stationnaire : dans ce type, les cellules se divisent jusqu'a former un tapis qui recouvre l'ensemble de la surface du support, ce stade est appele confluence.b- Culture en suspension : elle est realisee le plus souvent dans des flacons a agitation permanente afin d'eviter la decantation des cellules tels que : les flacons spinner (rotation magnetique) et les cytoculteurs .L'Equilibre du pH: Le pH du milieu et le pH intracellulaire sont des parametres cles controlant le bon fonctionnement metabolique, toute variation ou desequilibre de ces derniers peut engendrer de graves consequences sur le developpement et la survie cellulaires.L'ajout de ces substances varie en fonction des exigences du type cellulaire et de de l'objectif de la culture, on retrouve des hormones, facteurs de croissance, facteurs d'attachement, Antioxydants, les substances lipidiques et proteines de transport 5.NB: Il est important d'adapter la concentration des enzymes a la nature du tissu traite afin d'assurer une meilleure dissociation sans anomalies cellulaires ( trypsine :1 g de tissu pour 10 mL de solution). TYPES DE CULTURES CELLULAIRES Ils sont classes selon plusieurs criteres : 2.1) la morphologie cellulaire : Histologiquement on distingue : les cellules epitheliales, les cellules lymphoblastiques et les cellules fibroblastiques.C : flacons.1.2.?4.7.