لخّصلي

يُعتبر القياس الطيفي (Spectrophotometry) من أبرز الأساليب التحليلية المستعملة في تحديد تركيز المواد الكيميائية في المحاليل، وتُقاس شدة لونه طيفيًا عند طول موجي 750 نانومتر. وتوفر تقديرًا دقيقًا للتركيز الإجمالي للبروتينات في العينة. وتتميز بسرعةها وحساسيتها العالية، كما يمكن استعمال القياس الطيفي المباشر عند 280 نانومتر، لكنه يتطلب نقاءً عاليًا للعينة ولا يصلح للعينات المعقدة. BSA) لإنشاء منحنى قياسي تُقارن به امتصاص العينات المجهولة، ما يتيح حساب تركيز البروتين فيها بناءً على الامتصاص الطيفي الناتج.

يُعتبر القياس الطيفي (Spectrophotometry) من أبرز الأساليب التحليلية المستعملة في تحديد تركيز المواد الكيميائية في المحاليل، ويعتمد مبدأه على قياس مقدار الضوء الممتص أو المنعكس عند أطوال موجية محددة. في حالة البروتينات، يمكن استعمال تفاعل لوني لإنتاج مركب ملون تكون درجة امتصاصه الضوئي متناسبة طرديًا مع تركيز البروتين، مما يسمح بتحديد كميته بدقة.

من بين أكثر الاختبارات اللونية انتشارًا لتقدير البروتينات هو اختبار فولين-سيوكالتيو (المعروف باختبار لوري)، والذي يعتمد على تفاعل البروتين مع كاشفَي كاشف لوري الأساسي (مزيج من كبريتات النحاس في وسط قلوي) وكاشف فولين-سيوكالتيو. أوَّلاً، تتفاعل مجموعات الببتيد في البروتين مع أيونات النحاس الثنائية (+Cu²) مكونةً مركبًا معقدًا. بعد ذلك، يتفاعل هذا المركب مع كاشف فولين (مزيج من حمض الفوسفوموليبدك وحمض الفوسفوتنغستك) الذي يُختزل إلى مركب أزرق اللون (يُعرف بـ “الأزرق اللوري”)، وتُقاس شدة لونه طيفيًا عند طول موجي 750 نانومتر.

تُعد هذه الاختبارات اللونية مفيدة لأنها حساسة نسبيًا وسهلة التطبيق، وتوفر تقديرًا دقيقًا للتركيز الإجمالي للبروتينات في العينة. ومع ذلك، توجد طرق أخرى مثل طريقة برادفورد التي تستخدم صبغة Coomassie Brilliant Blue، وتتميز بسرعةها وحساسيتها العالية، لكنها قد تتأثر بنوع البروتين. كما يمكن استعمال القياس الطيفي المباشر عند 280 نانومتر، وهو يعتمد على امتصاص الأحماض الأمينية العطرية (التريبتوفان، التيروزين)، لكنه يتطلب نقاءً عاليًا للعينة ولا يصلح للعينات المعقدة.

ولضمان دقة النتائج، من الضروري استخدام بروتين قياسي معروف التركيز مثل ألبومين مصل البقر (Bovine Serum Albumin, BSA) لإنشاء منحنى قياسي تُقارن به امتصاص العينات المجهولة، ما يتيح حساب تركيز البروتين فيها بناءً على الامتصاص الطيفي الناتج.