لخّصلي

دراسة أنتاج أنزيم البروتيز من بعض الأحياء المجهرية+ STUDY OF PROTEASE PRODUCE BY SOME جندي علك مهدي* محمد رفيق علي** تم عزل بعض الأنواع من الأحياء المجهرية المنتجة لأنزيم البروتيز وشخصت هذه العزلات بـاجراء الفحوصات الشكليه والبايوكيميائيه المعتمده في التشخيص ولم يجرى فحـص API لعـدم تـوفره لـدينا Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis, Pseudomonas aeroginosa , Shigella flexnerie , Aspergillus niger تم قياس أنزيمات البروتيز لهذه الأجناس حيث بينت النتائج أن بكتريـا Bacillus subtilis اعطـت أعلى أنتاجية للبروتيز تلتها E. coli و Shigella و Pseudomonas بكلا الوسطين الطبيعي والصناعي كما وجد ان في الوسط الصناعي كانت أفضل في الانتاجيه من الوسط الطبيعي . التابعة لنفس الجنس . Abstract Some protease prolytic microorganism which were isolated and identified Bacillus subtilis Staphylococcus aureus , Staphylococcus epidermidis , Pseudomonas aeroginosa , Shigella flexnerie , E. coli and Aspergillus niger . coli, shigella, the synthetic medium is best than natural medium . Also we was found from results difference in enzyme activity in species Staphylococcus aureus according to isolates belong to same genus . + تاريخ استلام البحث ٢٠ / ١٠/ ٢٠٠٩ . تاريخ قبول البحث ٢٩ / ٣/ ٢٠٠٩ * استاذ مساعد - المعهد الطبي التقني / بغداد ** مدرس مساعد - المعهد الطبي التقني / بغداد  found the fungus Aspergillus was gave more activity for enzyme in compare with bacteria . This result show Aspergillus niger was gave production more than species of bacteria in this study . المقدمة يعتبر انزيم البروتيز من الأنزيمات الداخلية الخارجية المحللة للبروتينات ، الأنزيمات التي لاتفرز للوسط الا بعد تحلل الخلية ، ]1[ أن لأنزيمات البروتيز دور وأهمية كبيرة وذلك لدخولها بالعديد من الـصناعات )الـصناعات الغذائيـة كالأجبان وتطرية اللحوم( وكذلك في المعالجات الطبيعية كمعالجة الحروق الجلديـة ولـوحظ أن أنزيمـات البروتيز المنتجة من الأحياء المجهرية تلعب دور كبير ومهم في مقاومة هذه الأحياء للظروف غير الطبيعيـة وفي الأمراض التي تحدثها . ]2[ أن جنس Bacillus له القدرة على أنتاج أنزيمات البروتيز الخارجية في بداية طور الثبـوت وأن هـذه الأنزيمات تنتج دون الحاجة الى مادة محفزه . ]4[ أن أفضل الأحياء المجهرية التي يعتمد عليها في أنتاج أنزيمات البروتيز في الصناعة هـي Bacillus subtilis و Aspergillus niger و Aspergillus oryzus أذ تنتج هذه الأنواع أنزيمات مأمونة من الناحية الصحية أضافة الى كفاءة أنتاجها العالي . ]5[ المواد وطرائق العمل الأوساط الزرعية ١- وسط المرق OXOID ) Nutrient agar ( . ٢- وسط أغار الدم OXOID ) Blood agar( . ٣- وسط أغار الحليب OXOID )Milk agar( . الوسط المستخدم من قبل ]6[ ، 01 ، Cacl2 0. 3. 3 (NH4)2HPO4 6H2O 0. 002 ، ماء مقطر ١لتر( ٧- الوسط الطبيعي المستخدم لأنتاج أنزيمات البروتيز الخارجية هو مـستخلص التمـر وحـضر كـالآتي :)أضافة لتر من الماء المقطر الساخن )٧٥- ٨٠ C( لكل ١ كغم من التمر المنزوع النوى وترك لمـدة ٢٤ ساعة لغرض النقع وتسهيل أستخلاص السكريات منه ، KH2PO4 ٠, ٢٥ ، Trypton ٠, ٥% كما أشـار اليهـا ]10[ . تقدير كمية البروتين قدرت حسب Haltree المحورة لطريقة ]12[ . تعيين الوزن الجاف استخرج الوزن الجاف )غم/١٠٠مل( على اساس النسبة المئوية بعد تلقيح الوسط الزرعي بالكائن المجهري وبعد فترة تنميه محدوده يرشح الوسط الغذائي خلال اوراق ترشيح مجففه معلومة الوزن . حيث يستخدم للبكتريا اوراق دقيقة الثقـوب وللفطريـات اوراق ترشـيح )واتمان رقم ٢( . في ميزان حساس ويستخرج الوزن الجاف )غم /١٠٠ مل (او على اساس نسبه مئويه )AOAC(]13[ تقدير السكريات المتبقية بالوسط قدرت باستخدام الطريقة المتبعة من قل بيرسون لتقدير كمية السكر المتبقي وتعتمد الطريقه على اختزال المركب )Dinitro Salycilic acid (DNS 3, 5 الى amino , 5 nitro salycilic acid-3 وتتلخص الطريقه كالاتي: ١-يوخذ ٢٠ مل من المحلول المراد تعيين كمية السكر فيه ويوضع في دوارق سعة ٢٥٠مل ويضاف اليه ١٥ مل من حامض الهيدروكلوريك )١ عياري ( بعدها يكمل الحجم الى ١٥٠ مل باستعمال المـاع المقطر . ٢-يسخن الدورق ثم تحسب دقيقتين عند بدء الغليان ثم يبرد مباشره باستخدام حمام ثلجي . ٣- تضاف قطرتين من صبغة الفينونفثالين ويسحح المحلول ضد محلـول قاعـدي مـن هيدروكـسيد الصوديوم )١٠ /( ويوقف التسحيح عنداختفاع لون الصبغه . بعدها يكمل الحجم الى ٢٠٠ مل . ٤-يؤخذ ١ مل من المحلول السكري )الفقره ٣( ويضاف اليه ١ مل من ال )DNS ( ويحضر محلـول ٦ ، ٠, ١ملغم /مل ( وتقرأ ضد السيطرة الذي يحوي ١ مل من الماء المقطر على طول موجي ٥٤٠ نانوميتر . تم التعبير عن تركيز السكر بوحدة ) غم / ١٠٠ مل (]14[ . النتائج والمناقشة تم عزل أكثر من )٩٠( عزلة وبعد أختبار قابليتهاعلى أنتاج أنزيمات البروتيز ظهرت هنـاك )٦( شخصت العزلات البكتيرية بدراسة الصفات المظهرية وبعض الفحوصـات الكيميائيـة الحياتيـة وبالاعتماد على Bergys manual حيث حددت هي العزلات وعلى التوالي : Staphylococcus =A٣ ، Staphylococcus aureus=A2 ، Shigella flexnerie =A5 ، Pseudomonas aeroginosa =A4 ، epidermidis E. السبورية جدول )١( الصفات المظهرية والفحوصات الكيميائية الحياتية لعزلات البكتريا المنتجة لأنزيم البروتيز بنية برتقالي بيضاء مضيئة شاحبة وردية غامق )عديمة اللون( ٢ الشكل ٣ صبغة غرام ٤ أنتــــاجأنــــزيم + + d + + + كاتليزcatalyase ٥ الانـــزيمالمحلـــل + d d - - d للنشأ amylase ٨ استهلاك المانيتول ١٠ أستهلاك الارجنين ١١الحركة ١٦ تكوين السبورات )+( تفاعل أيجابي )-( تفاعل سلبي +++dd+ -+++++ -+-+-+ +++--- +----- ++++++ ddd-+d 35 1. ٢٤ 0. 25 العزلات ١ ٢ ٣ ٤ ٥ ٦ ٧ ٢٤ 0. 11 البروتين )ملغم/مل( 3. 24 48 0. 64 8. 20 0. 18 Bacillus subtilis ٢ Pseudomonas aeroginosa ٣ E. coli ٤ Shigella flexnerie ٥ Staphylococcus aureus ٦ Staphylococcus epidermidis ٧ A.J. Academic press, V., Bondarchuk A. Ya. Biochem . P. N., Stoeva S. A., M. Biochem . 56(6) : 543-544. K. and Egorov, N., Pillal K. F. and Subbar B. Al-Hilli, 6(3): 57-69. 11-Kundo, Microbiol. 30(4): 507-513. 1975 N. J., R. J. 14- Pearson D . 15-Kimura, T. and Tsuchiya,

دراسة أنتاج أنزيم البروتيز من بعض الأحياء المجهرية+ STUDY OF PROTEASE PRODUCE BY SOME
MICROORGANISM A
جندي علك مهدي* محمد رفيق علي**
المستخلص
تم عزل بعض الأنواع من الأحياء المجهرية المنتجة لأنزيم البروتيز وشخصت هذه العزلات بـاجراء
الفحوصات الشكليه والبايوكيميائيه المعتمده في التشخيص ولم يجرى فحـص API لعـدم تـوفره لـدينا
والنتائج كالآتي :
Bacillus subtilis, Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis, Pseudomonas aeroginosa , Shigella flexnerie , E.coli , Aspergillus niger
تم قياس أنزيمات البروتيز لهذه الأجناس حيث بينت النتائج أن بكتريـا Bacillus subtilis اعطـت أعلى أنتاجية للبروتيز تلتها E.coli و Shigella و Pseudomonas بكلا الوسطين الطبيعي والصناعي كما وجد ان في الوسط الصناعي كانت أفضل في الانتاجيه من الوسط الطبيعي .
كما لوحظ أن هناك أختلاف بفاعلية الأنزيم ببكتريا Staphylococcus aureus مقارنه بـالعزلات
التابعة لنفس الجنس . وعند المقارنة بين كل انواع البكتريا قيد الدراسه والفطر Aspergillus لـوحظ أن الفطر أعطى أنتاجية عالية للبروتيز .
Abstract
Some protease prolytic microorganism which were isolated and identified Bacillus subtilis Staphylococcus aureus , Staphylococcus epidermidis , Pseudomonas aeroginosa , Shigella flexnerie , E.coli and Aspergillus niger .
Protease enzyme were determined from these isolates , and we found bacteria Bacillus was gave higher production according with another bacteria, E.coli, shigella, pseudomonas, the synthetic medium is best than natural medium .
Also we was found from results difference in enzyme activity in species Staphylococcus aureus according to isolates belong to same genus .and also we

• تاريخ استلام البحث ٢٠ / ١٠/ ٢٠٠٩ . تاريخ قبول البحث ٢٩ / ٣/ ٢٠٠٩ * استاذ مساعد - المعهد الطبي التقني / بغداد ** مدرس مساعد - المعهد الطبي التقني / بغداد
  
  found the fungus Aspergillus was gave more activity for enzyme in compare with bacteria .
  This result show Aspergillus niger was gave production more than species of bacteria in this study .
  المقدمة يعتبر انزيم البروتيز من الأنزيمات الداخلية الخارجية المحللة للبروتينات ، فالأنزيمات الداخليـة هـي
  الأنزيمات التي لاتفرز للوسط الا بعد تحلل الخلية ، أما الأنزيمات الخارجية فهي تفرز للوسـط طبيعيـ ًا دون تحلل الخلية . ]1[
  أن لأنزيمات البروتيز دور وأهمية كبيرة وذلك لدخولها بالعديد من الـصناعات )الـصناعات الغذائيـة كالأجبان وتطرية اللحوم( وكذلك في المعالجات الطبيعية كمعالجة الحروق الجلديـة ولـوحظ أن أنزيمـات البروتيز المنتجة من الأحياء المجهرية تلعب دور كبير ومهم في مقاومة هذه الأحياء للظروف غير الطبيعيـة
  وفي الأمراض التي تحدثها . ]2[ أن جنس Bacillus له القدرة على أنتاج أنزيمات البروتيز الخارجية في بداية طور الثبـوت وأن هـذه
  الأنزيمات تنتج دون الحاجة الى مادة محفزه . ]3[ أن جنسي Pscudomonas و Staphylococcus لها القدرة على أنتاج أنزيمات البروتيز بكميات جيدة
  . ]4[ أن أفضل الأحياء المجهرية التي يعتمد عليها في أنتاج أنزيمات البروتيز في الصناعة هـي Bacillus
  subtilis و Aspergillus niger و Aspergillus oryzus أذ تنتج هذه الأنواع أنزيمات مأمونة من الناحية الصحية أضافة الى كفاءة أنتاجها العالي . ]5[
  المواد وطرائق العمل الأوساط الزرعية
  ١- وسط المرق OXOID ) Nutrient agar ( . ٢- وسط أغار الدم OXOID ) Blood agar( . ٣- وسط أغار الحليب OXOID )Milk agar( . ٤- الوسط الصناعي المستخدم لتنمية بكتريا Staphylococcus aureus لغرض انتـاج البروتيـز وهـو
  الوسط المستخدم من قبل ]6[ ، والمتكون من المواد التالية )غم/لتر( )كـازئين ١٥، كليـسرول ١٠ ، خلاصـة الخميـرة ٥ ، Mncl2.H2O ، 0.2 MgSO4.7H2O ، 2.4 KHPO4 ، 0.4 KH2PO4 0.01 ، Cacl2 0.74 ، ماء مقطر ١لتر( .
  ٥- الوسط الصناعي المستخدم لأنتاج أنزيمات البروتيز الخارجية لبكتريا Bacillus هو الوسط المـستخدم من قبل ]7[ والمتكون من المواد التالية )غم/لتر( )كلوكــــوز ١٠ ، Fecl3.6H2O ، 1.5 MgSO4.7H2O ، 1 KH2PO4 ، 3.3 (NH4)2HPO4
  0,001 ، ماء مقطر ١لتر( .
  ٦- الوسط الصناعي المستخدم لتنمية بكتريا Pseudomonas هو الوسط المستخدم من قبل ]8[ والمتكـون من المود اتالية )غم/لتر(
  
  )كــازائين ٥ ، ZnSO4.7H2O ، 0.5 MgSO4.7H2O ، 0.5 KH2PO4 ، 1 K2HPO4 0.01 ، Fecl3.6H2O 0.002 ، ماء مقطر ١لتر(
  ٧- الوسط الطبيعي المستخدم لأنتاج أنزيمات البروتيز الخارجية هو مـستخلص التمـر وحـضر كـالآتي :)أضافة لتر من الماء المقطر الساخن )٧٥- ٨٠ C( لكل ١ كغم من التمر المنزوع النوى وترك لمـدة ٢٤ ساعة لغرض النقع وتسهيل أستخلاص السكريات منه ، رشح الوسط عبر قطعة شاش معقمه وحفظ
  بالمجمدة لحين الأستخدام ]9[ . أضف للوسط الأملاح التالية : )NH4)2SO4( ٠,٣% ، MgSO4 ٠,٣٢ ، KH2PO4 ٠,٢٥ ، Trypton ٠,٥% كما أشـار اليهـا ]10[ .
  قياس فعالية أنزيم البروتيز تم قياسها حسب الطريقة المتبعة من قبل ]11[ .
  تقدير كمية البروتين قدرت حسب Haltree المحورة لطريقة ]12[ .
  تعيين الوزن الجاف استخرج الوزن الجاف )غم/١٠٠مل( على اساس النسبة المئوية بعد تلقيح الوسط الزرعي بالكائن المجهري وبعد فترة تنميه محدوده يرشح الوسط الغذائي خلال اوراق
  ترشيح مجففه معلومة الوزن .حيث يستخدم للبكتريا اوراق دقيقة الثقـوب وللفطريـات اوراق ترشـيح )واتمان رقم ٢( .بعد عملية الترشيح تغسل الورقة وما تحتويه بالماء المقطر المعقم عدة مرات وتوضـع اوراق الترشيح بالفرن بدرجة ٦٠م لمدة ٢٤ ساعه ثم تنقل الاوراق الى قارورة التجفيف لتبرد ثم توزن
  في ميزان حساس ويستخرج الوزن الجاف )غم /١٠٠ مل (او على اساس نسبه مئويه )AOAC(]13[ تقدير السكريات المتبقية بالوسط
  قدرت باستخدام الطريقة المتبعة من قل بيرسون لتقدير كمية السكر المتبقي وتعتمد الطريقه على اختزال المركب )Dinitro Salycilic acid (DNS 3,5 الى amino , 5 nitro salycilic acid-3
  وتتلخص الطريقه كالاتي: ١-يوخذ ٢٠ مل من المحلول المراد تعيين كمية السكر فيه ويوضع في دوارق سعة ٢٥٠مل ويضاف
  اليه ١٥ مل من حامض الهيدروكلوريك )١ عياري ( بعدها يكمل الحجم الى ١٥٠ مل باستعمال المـاع المقطر .
  ٢-يسخن الدورق ثم تحسب دقيقتين عند بدء الغليان ثم يبرد مباشره باستخدام حمام ثلجي . ٣- تضاف قطرتين من صبغة الفينونفثالين ويسحح المحلول ضد محلـول قاعـدي مـن هيدروكـسيد
  الصوديوم )١٠ /( ويوقف التسحيح عنداختفاع لون الصبغه . بعدها يكمل الحجم الى ٢٠٠ مل . ٤-يؤخذ ١ مل من المحلول السكري )الفقره ٣( ويضاف اليه ١ مل من ال )DNS ( ويحضر محلـول
  السيطره من اضافة ١ مل من كاشف DNS الى ١ مل من الماء المقطر ثم توضع الانابيب فـي حمـام مائي مغلي لمدة ٥ دقائق ثم يبرد بسرعة باستخدام الماء الجاري ) ماء الصنوبر ( .
  ٥- يضاف الى كل انبوب ١٠ مل نت الملء المقطر ثم يقرأ الامتصاص علـى طـول مـوجي ٥٤٠ نانوميتر .
  ٦- يحضر المنحني القياسي باستخدام تراكبز مختلفة منسكر الكلوكـوز ) ٠,٢ ، ٠,٤ ، ٠,٦ ، ٠,٨ ، ١ملغم /مل ( وتقرأ ضد السيطرة الذي يحوي ١ مل من الماء المقطر على طول موجي ٥٤٠ نانوميتر .
  تم التعبير عن تركيز السكر بوحدة ) غم / ١٠٠ مل (]14[ .
  النتائج والمناقشة
  تم عزل أكثر من )٩٠( عزلة وبعد أختبار قابليتهاعلى أنتاج أنزيمات البروتيز ظهرت هنـاك )٦(
  عزلات بكتيرية و )١( فطرية لها القدرة على أنتاج أنزيمات البروتيز .
  شخصت العزلات البكتيرية بدراسة الصفات المظهرية وبعض الفحوصـات الكيميائيـة الحياتيـة
  وبالاعتماد على Bergys manual حيث حددت هي العزلات وعلى التوالي :
  Staphylococcus =A٣ ، Staphylococcus aureus=A2 ، Bacillus Subtilis=A1 =A6 ، Shigella flexnerie =A5 ، Pseudomonas aeroginosa =A4 ، epidermidis
  . E.coli أما الفطريات فقد تم تشخيص الفطر Aspergillus niger على اساس شكل المستعمرات وحامل العلب
  السبورية جدول )١( الصفات المظهرية والفحوصات الكيميائية الحياتية لعزلات البكتريا المنتجة لأنزيم البروتيز
  ت الاختبار A6 A5 A4 A3 A2 A1
  بنية برتقالي بيضاء مضيئة شاحبة وردية غامق )عديمة اللون(
  ١ لون المستعمرة
  ٢ الشكل ٣ صبغة غرام ٤ أنتــــاجأنــــزيم + + d + + +
  كاتليزcatalyase
  ٥ الانـــزيمالمحلـــل + d d - - d
  للنشأ amylase
  ٦ الانزيم المحلـل للجلاتـين + + d d + d gelatinase
  ٧ استهلاكالكلوكوز + + + + + +
  عصوية كروية كروية عصوية عصوية عصوية
  G-ve G-ve G-ve G+ve G+ve G+ve
  
  - +
  d+-++
  ٨ استهلاك المانيتول
  ٩ استهلاك الارابينوز
  ١٠ أستهلاك الارجنين
  ١١الحركة
  ١٢ النمو على وسط %7 Nacl
  ١٣ النمو بدرجة حرارة 4C
  ١٤ النمو بدرجة حرارة 41C Coagulase١٥
  ١٦ تكوين السبورات )+( تفاعل أيجابي )-( تفاعل سلبي
  +++dd+ -+++++ -+-+-+
  +++--- +----- ++++++ ddd-+d
  +----- )d( ضعيف
  أستخدمت عزلات الاحياء المجهرية المشخصة لانتاج أنزيمات البروتيز وكانت أفضل العـزلات هـي الفطر Aspergillus nijer تلتها البكتريا وعلى التوالي Bacillus subtilis و Pseudomonas و E.coli و Shigella وأخير ًا Staphylococcus وكما موضح بالجدول رقم )٢(
  جدول رقم )٢( : أنتاج أنزيمات البروتيز والكتلة الحيوية والبروتين لعزلات الاحياء المجهرية بأستخدام أوساط صناعية
  أنتاج البروتيز )وحدة/مل( 2.10 1.85 1.40 1.35 1.20 0.25 0.18
  فترة الحضن الكتلة الحيوية % البروتين )ساعة( )غم/١٠٠مل( )ملغم/مل(
  ٢٤ 26.٠ 4.48 ٢٤ 0.24 0.20 ٢٤ 0.15 0.08 ٢٤ 0.19 0.12 ٢٤ 0.17 0.10
  ٢٤ 0.80 11.25
  العزلات
  Aspergillus niger Bacillus subtilis Pseudomonas aeroginosa E.coli
  Shigella flexnerie Staphylococcus aureus Staphylococcus epidermidis
  ت
  ١ ٢ ٣ ٤ ٥ ٦ ٧
  ٢٤ 0.06 10.11
  يلاحظ أن بكتريا Staphylococcus aureus أظهرت أنتاجية عالية للبروتين مقارنة مع بقية العزلات حيث بلغت ١١,٢٥ غم/مل ولم يظهر الجدول )٢( فروق ًا كبيرة في الكتلة الحيوية بين العزلات النامية علـى
  الوسط الصناعي . جدول )٣( : أنتاج أنزيمات البروتيز والكتلة الحيوية والبروتين لعزلات الاحياء المجهرية بأستخدام وسط عصير التمر
  أنتاج البروتيز )وحدة/مل( 1.92
  البروتين )ملغم/مل( 3.20
  فترة الحضن الكتلة الحيوية %
  ت العزلات 0.27 48 Aspergillus nijer ١
  )ساعة( )غم/١٠٠مل(
  
  48 0.26 0.19 1.45 48 0.17 0.08 1.25 48 0.21 0.10 1.18 48 0.17 0.10 1.17 48 0.87 9.18 0.24 48 0.64 8.20 0.18
  Bacillus subtilis ٢ Pseudomonas aeroginosa ٣ E.coli ٤ Shigella flexnerie ٥ Staphylococcus aureus ٦ Staphylococcus epidermidis ٧
  يظهر الجدول أعلاه قلة أنتاجية الانزيم لكل العزلات النامية على وسط عصير التمـر وكـذلك زيـادة واضحة في الكتلة الحيوية مع قلة في كمية البروتين ويمكن تفسير ذلك لوجود السكر )المـصدر الكـاربوني( بالوسط حيث له تأثير سلبي على أنتاجية أنزيم البروتيز بدليل عدم ظهوره خلال ٢٤ ساعة وأنما أستمر الـى ٤٨ ساعة بعدها بدأت الانتاجية تظهر لأن نسبة السكر المتبقي بالوسط قد تلاشت باليوم الثاني لاستهلاكه من قبل الاحياء المجهرية ، ولوجود السكر بالوسط أدى لحدوث زيادة الكتلة الحيوية بنسبة ملحوظة تتفـق مـع ماتوصل اليه ك ًلا من ] ١٦ و ١٥ [ حيث وجدوا أن أعلى أنتاجية لانزيمات البروتيز الخارجية ظهرت بغياب المصدر الكاربوني )السكر( وأن الانتاجية تظهر باليوم الاول من النمو وأشاروا الى أن وجود أي تركيز من
  سكر الكلوكوز يؤدي لخفض أنتاجية الانزيم . أشار ]17[ الى التأثير السلبي للسكريات على أنتاجية الانزيم وخصوص ًا في الفطر Aspergillus niger .
  Reference
  1- Barrett,A.J., Rawling N.D., Woessner J.F. "The Hand book of proteolytic enzyme" 2nd ed. Academic press, 2003 .
  2- Hooper,N.M.,"Proteasesinbiologyandmedicine"London:porttandpress,2002 .
  3- Koltukova, N.V., Bondarchuk A.A., Zakharova I.Ya., Valueva T.A. and Mosolov V.V. "Some physiochemical proprieties of Bacillus mesenticus" Appl. Biochem . Microbiol. 21(4) : 400-405 . 1985 .
  4- Doloshka, P.N., Georgieva O.N., Stoeva S.R., Genov N.M., and Vrelter W.A., "Anovel thermostable neutral proteinase from microorganisms" Biophys . acta . 1998 . 207-216 : )2( 1382
  5- Taylor, M.J., and Richardsont . "Application microbial enzyme in food system and in biotechnology" Advances in appl. Microbial. 25:7-21 . 1989.
  6- Drapeau, G.R. "The primary structure of staphylococcal protease" Can. J. Biochem . 56(6) : 543-544. 1978 .
  7- Cherdyntseva, T.A., Razinkov, V.K. and Egorov, N.S. "Biosynthesis by Bacillus subtilis var amyloliquefaciens of an extracellular protease exhibiting coagulase activity and nitrogen sources" . Microbiol (USSR) . 51(3) : 356-366. 1982 .
  8- Nigam, J.N., Pillal K.R. and Baruah J.N. "Effect of carbon and nitrogen sources on neutral proteinase production by pseudomonas aeroginosa" . Folia microbial . 1981 .358-363 :26
  9- Benjamin, N.D., Abbas M.F. and Subbar B.H. "Preparation and classification of adata juice" . Preperation Jrawr 1(2): 75-87. 1982
  
  10- Al-Obaidi, Z.S., Al-Tai, W.E., Al-Hilli, M.A. and Al-Hakkak, Th.S. "Screening of fungal strains for amylase production" . Agric. Water. Reso. Res. 6(3): 57-69. 1987
  11-Kundo, A.K. and Manna, S. "Purification and characterization of extra cellular proteinases of Aspergillus" Appl. Microbiol. 30(4): 507-513. 1975
  12-Lowry, O.H., Rosebrough, N.J., Lewisfar, A. and Randall, R.J. "Protein measurement with the folin – phenol reagent" . J.Biol-Chem . 194:265-275 . 1951
  13- Association of official Analytical chemists (AOAC) . "Official method of analysis . Published by the Association of official analytical chemists" Washington D.C., 12th ed. 1973
  14- Pearson D ., "The chemical analysis of food " 7th , Churchill Livingston .English &London .1973 .
  15-Kimura, T. and Tsuchiya, K. "Characteristics of protease production by cephalosporium spp" . Appl. Env. Microbial . 43(3): 654-658 . 1982
  16-Kasanah, N., Humann, M.T, "Development of antibiotic and the future of microorganism" . Curr. Inves. Drugs. 5(8): 827-837 .
  المصادر العربية ١٧- السعيد ، محمد "بعض العوامل التي تؤثر على أنتاجية وفعالية أنزيمات البروتيـز الخارجيـة للفطـر
  . ١٩٨٩ "Aspergillus niger