تحليلالتوافق الحيوي للمواد المرشحة القائمة على حمض البوليكتيك
للدعاماتالقلبية الوعائية في نموذج زرع تحت الجلد للفئران
راميااهوجاأ1,نيشا كوماريأ1,ألوك سريفاستافاأبوجا بهاتيببريا فاشيستأ, بي كيه يادافج, توني جاكوبد
راجيفنارانجهـنارش بهاتناجارأ,*
أقسم الهندسة الميكانيكية، المعهد الهندي للتكنولوجيا، دلهي، الهند
بقسم الهندسة الميكانيكية والأتمتة، جامعة أنديرا غاندي دلهي التقنية للنساء، الهند
جمرفق الحيوان المركزي، معهد عموم الهند للعلوم الطبية، دلهي، الهند
دقسم التشريح، معهد عموم الهند للعلوم الطبية، دلهي، الهند
هـقسم أمراض القلب، معهد عموم الهند للعلوم الطبية، دلهي، الهند
معلوماتالمقال خلاصة
الكلماتالمفتاحية:
حمضالبوليكتيك (PLA(
المغنيسيوم(ملغ)
اختبارتحت الجلد للفئران
هياكلوعائية قابلة للتحلل البيولوجي (BVS(
بوليكابرولاكتون (PCL(
إنتعديل حمض البولي لاكتيك (PLA(، وهو بوليمر حيوي، هو استراتيجية لا تزال قيد الاستكشاف الكامل للجيل القادم من المواد الحيوية
للدعاماتالوعائية القابلة للتحلل الحيوي (BVS(. مع هذا التركيز، تم اختبار ما يصل إلى ٪5 من بولي كابرولاكتون (PCL (والمغنيسيوم في PLA
فينموذج تحت الجلد للفئران وتم وصف تفاعلاتها الخلوية والأنسجة، وخاصة فيما يتعلق بالاستجابة الالتهابية وتكوين الأوعية الدموية وتكوين
الكبسولة.تم تقدير السيتوكينات 6IL وAlpha TNF وBeta-1IL في الأنسجة المحيطة بالزرع، والتي أظهرت جميعها فرقاً غير مهم بين الحيوانات
غيرالمزروعة وتلك التي تحتوي على PLA بحلول 8 أسابيع، مما يشير إلى الطبيعة الحميدة لـ PLA كمادة حيوية للزرع. وقد زاد كلا المادتين
المعدلتينمن عدد الخلايا البلعمية ومستويات السيتوكين، باستثناء 6IL عند 8 أسابيع. كان تكوين الأوعية الدموية عند 8 أسابيع فقط في
الأنسجةالمحتوية على PCL PLA أعلى بشكل ملحوظ من PLA النقي، والذي يمكن التحكم فيه بعناية أكبر جنباً إلى جنب مع كراهية المادة للماء
منأجل الجهود المحتملة نحو تكوين الأوعية الدموية العلاجية. لم يظُهر سمك الكبسولة، المقاس عن طريق التلوين بكل من الهيماتوكسيلين
والإيوسينوشعر ماسون، أي اختلافات بين المواد، بما في ذلك PLA.
.1المقدمة يمكنتغيير الخواص الميكانيكية وخصائص التحلل عن طريق إضافة مواد حيوية أخرى
إلىPLA. بولي كابرولاكتون (PCL (والمغنيسيوم (Mg (من بين هذه المواد المعدلة، والتي
تمتدراستها هنا.
بولي-ل- تم إثبات أن حمض اللاكتيك (PLLA (مع جزء صغير من أيزومر D هو المادة
الحيويةالمفضلة من حيث الخصائص الميكانيكية وقابلية المعالجة للغرسات العظمية (
يونوآخرون، 2017بالنسبة للدعامات، لا يزال من غير الممكن تحديد التركيبة المتماثلة
المثالية،على الرغم من أنه من الممكن استخدام تحول نافذة المعالجة بسهولة لاستيعاب
الاختلافات(أليكسي وليفي، 2013). مقدمة عن
د- يقلل الكسر أيضاً من وقت التحلل، كما هو موضح ومسُتخدم في دعامة ART) تقنيات
إعادةتشكيل الشرايين) (ماكماهون وآخرون، 2018). إن الخصائص الجوهرية لحمض
البوليلاكتيك محدودة حيث يتعرض حمض البولي لاكتيك النقي لكسر هش. يضيف
أيزومرD طابعاً غير متبلور، إلا أن هذا يؤثر سلباً على قوة الشد للبوليمر المتماثل (لي
وآخرون2016،). يعد المزج والبلمرة المشتركة مع مونومرات أخرى طريقة أخرى تم
استكشافهامؤخراً لتغيير
النموذجالجديد في دعامات الشرايين التاجية هو دعامة وعائية قابلة للتحلل
البيولوجي(BVS (تذوب؛ ومن الناحية المثالية في الجدول الزمني لإعادة تشكيل تجويف
الشرايينواستعادة الحركة الوعائية الطبيعية. يتم ضغط اللويحة التصلبية بواسطة قوى
النشر(كيني وآخرون، 1984)، والتي تؤدي الوظيفة الأساسية للدعامة، تليها عملية البطانة
أوتكوين الطبقة الداخلية الجديدة (فورستر وآخرون، 1991). بعد عملية التغليف البطاني،
تقلالحاجة إلى الدعامة تدريجياً (أوبرهاوزر وآخرون، 2009). يمتلك حمض البوليكتيك
(PLA (القدرة على قيادة هذه الثورة واستبدال الدعامات المعدنية الدائمة، باعتباره
بوليستراًقابلاً للتحلل البيولوجي ومتاحاً بسهولة، وقد أظهر في البداية سلوك تحلل إيجابياً
فيالتجارب السريرية (فرح وآخرون 2016؛أجراوال وآخرون، 1992؛ماكماهون وآخرون،
2018). ومع ذلك، وعلى الرغم من العديد من الفوائد المتصورة، تم الإبلاغ عن تكوين
الجلطاتفي الدراسات ذات المدة الأطول، مما أثار الكثير من الأسئلة حول آثار اختيار
مادةBVS) بوريسيل وآخرون، 2016). ال
- المؤلف المراسل.
عنوانالبريد الإلكتروني:ناريشب@in.ac.iitd.mech) ن. بهاتناجار).
1ساهم كلا المؤلفين بالتساوي في هذا العمل.
https://doi.org/10.1016/j.actis.2020.151615
تمالاستلام في 17 مارس 2020؛ تم الاستلام في شكل منقح في 8 أغسطس 2020؛ تم القبول في 11 أغسطس 2020
متاحعبر الإنترنت في 9 سبتمبر 2020
.جميعالحقوق محفوظة .GmbH Elsevier 2020© 0065-1281/
مترجم من الإنجليزية إلى العربية - com.onlinedoctranslator.www
ر.أهوجا وآخرون. اكتاهيستوتشيميكا 122 (2020) 151615
الخواصالميكانيكية لـ PLLA. يساعد استخدام المواد الحيوية المعروفة لهذا الغرض، مثل
بوليكابرولاكتون (PCL(، في عملية نقل التكنولوجيا إلى العيادة (فريدمان وموني، 2019).
يتمتحفيز تحلل كل من PLA وPCL عن طريق التحلل المائي للروابط الإسترية الموجودة
فيهما(جيرا وسيورانا، 2018لا يوجد بحث في الدعامات المركبة المصنوعة من
البوليمراتوالمعادن القابلة للتحلل البيولوجي، على الرغم من دراسة الدعامات المعدنية
القابلةللتحلل البيولوجي المصنوعة من السبائك القائمة على الحديد والمغنيسيوم (
هانوآخرون، 2019؛بيرسون وآخرون، 2012). وقد افترض أن منتجات التحلل الأساسية
للموادالمعدنية لها فائدة إضافية تتمثل في تقليل الالتهاب/التفاعل الناتج عن منتجات
PLA الحمضية (وانج وآخرون، 2018).
فيالمختبروفي الجسم الحيتم إجراء دراسات على PLA والبوليمرات القابلة للتحلل
البيولوجيالأخرى للاستخدام الطبي منذ أوائل التسعينيات مع التركيز في العمل الأخير
علىغرسات محددة أو استراتيجيات زرع مصممة بناء ًعلى التطبيق المستهدف (
جوجوليوسكيوآخرون، 1993؛صن وآخرون، 2010؛تيل وآخرون، 2016). تم تحديد
النموذجتحت الجلد وعملية تكوين الكبسولة الليفية كأداة لفهم معدل تكوين الكولاجين
وتدهورهخلال فترة زمنية معينة من الدراسة (شرقاوي وآخرون، 1997؛كيم وآخرون، 2011
؛لياو وآخرون، 2017). على الجانب الآخر، قد يشير تحلل الكبسولة إلى الشفاء وقد لا
يشيرإليه وقد لا يكون مفيداً لتطبيق الدعامة القلبية الوعائية، حيث أن تكوين الكبسولة،
علىغرار تكوين الطبقة الداخلية حول الدعامات المنشورة، من شأنه أن يساهم في
تثبيتاللويحة (أويدا وآخرون، 2015وقد ثبت أن هذا ينطبق بشكل خاص على اللويحة
الدهنية،والتي يتم تحديدها من خلال اللون الناتج في تنظير الشرايين التاجية، وهو ما
يشكلخطراً متزايداً لفشل الدعامة في وقت متأخر جداً (سوزوكي وآخرون، 2018).
كانPLA وPCL، إلى جانب بولي-3-هيدروكسي بيوتيرات (PHB(، جزءاً من دراسة
مفصلةأجراها كاستيلانو وآخرون فيما يتعلق بإمكانية إصلاح الأنسجة القلبية الوعائية
الناجمةعن العمليات الالتهابية، وهو المبدأ الذي طبقه أيضاً كلوين وآخرون بنجاح. (صن
وآخرون2010،؛كلوين وآخرون، 2017). كانت سلامة المواد الحيوية والتعبير عن
السيتوكينات-6،IL وβ-1IL من بين المعايير التي تمت مقارنتها والإبلاغ عنها فيما يتعلق
بالضوابطالتي لم تخضع لتدخل جراحي. علاوة على ذلك، نظراً لأن α-TNF وβ-1IL يتم
إطلاقهمابواسطة الخلايا البلعمية المنشطة، يمكن ربط زيادة التعبير عنهما بخلايا التهابية
مزمنةتغزو موقع الزرع. قد يتم إفراز -6IL أيضاً بواسطة الخلايا البائية حتى قبل هذه
السيتوكيناتوقد تم ربطه بنشاط الخلايا الوحيدة (بنيهود وآخرون، 2007؛راموت وآخرون،
2016؛ريكمان وآخرون، 1997وبالتالي، في هذه الدراسة، بالإضافة إلى تحليل
السيتوكين،يتم إجراء دراسة نسيجية مرضية للخلايا الالتهابية وتكوين الكولاجين. وفي
حينتوجد العديد من الدراسات لغرسات PLA ذات الأشكال الهندسية المختلفة
للتطبيق،فإن إدراج PCL عن طريق المعالجة الثانوية لم يتم فحصه على نطاق واسع. لا
توجدحقن تحت الجلد أو الأبهرية سابقةفي الجسم الحيوقد تم الإبلاغ عن دراسات
لقياساستجابة الأنسجة الشافية لإدراج المغنيسيوم لتعديل PLA) وونغ وآخرون، 2019؛
رضوانوآخرون، 2006).
تمخلط Mg-PLA يدوياً مع PLA النقي لسهولة المعالجة ونسبة مئوية نهائية أقل (٪2 و
٪4بالوزن).
تمتقطيع الأنابيب طولياً باستخدام شفرات حلاقة حادة لعينات بطول 7 مم. تم
قياسالقطر بشكل عمودي مرتين لمراعاة عدم الدائرية الناتجة عن حركة اليرقة بعد
البثقوالسمك في خمس نقاط عشوائية للتباين في تدفق المواد باستخدام الفرجار
الإلكتروني(Japan Mitutoyo Digimatic Absolute(. تمت ملاحظة أوزان القطع
الفرديةبميزان تحليلي شبه دقيق (202GR AND (بعد التجفيف عند 55 درجة فهرنهايت.
◦ج ل≥12 ساعة. كان متوسط قطر العينة وسمكها ووزنها بعد أسبوعين 0.11±2.92
ملم22±134، ميكرومتر و0.7±8.3 ملغ (ن = 20)؛ وفي 8 أسابيع كان 0.08±2.91 ملم،
23±128 ميكرومتر و0.8±8.4 مجم (ن = 31). تم فحص العينات بالموجات فوق
الصوتية(D230CP Powersonic Ultrasonics Crest (باستخدام الماء منزوع الأيونات
لمدة15 دقيقة وشطفها بمحلول إيثانول (٪75 في الماء) لمدة 5 دقائق لإزالة أي غبار
وتلوثسطحي على التوالي. تم تعبئة العينات الفردية في مربعات تايفك، مملوءة
بالنيتروجين2
ومصُنفللتعقيم النهائي عن طريق التعرض لغاز أكسيد الإيثيلين، كما تم فحصه
بواسطة )250C MULTIVAC)سافاريس وآخرون (2017).
.2.2نموذج الحيوان والتصميم التجريبي
تمالحصول على ثمانية عشر فأراً ذكراً من نوع ويستار، يتراوح وزن كل منها بين 200
و250جراما،ً من "مرفق الحيوان المركزي" في معهد عموم الهند للعلوم الطبية (AIIMS(
فيدلهي. كان الوزن الأولي للفئران 227 جراما16±.ً جم. تم تقسيم الحيوانات إلى
مجموعتينتضم كل منهما ثمانية فئران على الأقل (6 تجريبية و1 على الأقل ضابطة و1
وهمية). تم الاحتفاظ بجميع الفئران في أقفاص فردية وتم وضعها في منشأة يتم
التحكمفي درجة حرارتها. تمت الموافقة على الإجراءات الجراحية من قبل لجنة أخلاقيات
الحيوانالمؤسسية في )-1/2017IAEC44/ )Delhi AIIMS. تم تخصيص واحدة من
النقطتينالزمنيتين المحددتين لكل مجموعة، 2 و8 أسابيع (10 = n 8، = n(.
.2.2.1نموذج حيواني
تموضع الفئران في أقفاص من البولي كربونات، مع السماح لها بالوصول بحرية إلى
النظامالغذائي القياسي للقوارض والماء. تم زرع أقسام بطول 7 مم من الأنابيب
البوليمريةالمبثوقة تحت الجلد الجانبي الخلفي للحيوان لإثارة استجابة الأنسجة الشافية
وبدءالامتصاص الحيوي للبوليمر، كما هو موضح فيالشكل 1تم دراسة جرذان مع ما
يصلإلى 6 إدخالات لكل منهما، بناء ًعلى فعالية التخدير، لكل مادة في نقطة زمنية
معينة.تم إجراء عملية وهمية وفقاً للبروتوكول الجراحي باستثناء إدخال الغرسة. لم يتم
إجراءأي إجراء جراحي على الحيوان الضابط. تم تعيين عملية جراحية وهمية وضابط
منفصلةلكل يوم من أيام الجراحة. تم تسجيل وزن الجسم حتى التضحية لمراقبة صحة
الجرذان.
.2.2.2التصميم التجريبي
تماختبار ثلاثة مركبات ومخاليط حمض البوليكتيك (PLA(، حمض البوليكتيك بنسبة
%5 من وزن بولي كابرولاكتون وحمض البوليكتيك بنسبة %4 من وزن المغنيسيوم (Mg(
فيهذه الدراسة حيث تم اعتبار حمض البوليكتيك النقي مادة التحكم. في كل نقطة
زمنية،تم فصل الحيوانات بناء ًعلى المادة أو عدم وجود المادة كما هو موضح أدناه.
.2المواد والطرق
.2.1التصنيع وإعداد العينات
4032D، 96%L-lactide، 4%D-lactide( حبيبات تمتمعالجة
Natureworks )PLA وPCL بالنسب المحددة بواسطة آلة بثق لولبية مزدوجة
(Scientific ThermoFisher 16، EUROLAB PRISM (إلى خيوط للتكوير. مسحوق
المغنيسيومبحجم جسيمات 40 ميكرومتر (Aesar Alfa، عالي النقاء)>تم تقديم ،٪99.8
حجمشبكة 325) بشكل منفصل أيضاً كمادة حشو لدراسة تأثير زيادة خشونة السطح. تم
تحضيرمركبات المغنيسيوم وPLA بطريقة صب محلول معدلة حيث تم تجميع
الجسيماتوالحبيبات في الكلوروفورم كمذيب. تم استخدام إعداد يشبه الطارد اليدوي
لصنعخيوط تم تحبيبها يدويا.ً في كلتا العمليتين، كانت أبعاد الحبيبات النهائية بالغة
الأهميةللسماح بالحركة على طول برميل الطارد، وخاصة في المنطقتين الأولى والثانية.
تماستخدام طارد لولبي واحد (Engineering Labtech، تايلاند) مع 30 D / L وقالب
مخصصلمعالجة PLA ومواد PLA المعدلة في أنابيب بطريقة مستمرة محُسنَّة مسبقاً (
بهاتيوآخرون، 2019تم بثق PLA النقي والمخاليط مع PCL والمواد المركبة مع Mg.
1 PLA
5%2 بالوزن من PCL في مزيج 4% 3 )PCL
PLA )PLA بالوزن من Mg في مزيج 4 )Mg
PLA )PLA مادة وهمية ومراقبة (لا شيء)
فيكل من المجموعتين اللتين استغرقتا أسبوعين وثمانية أسابيع، تم إعدام جميع
الفئرانفي كل مجموعة لإزالة العينات والأنسجة والبلازما لدراسة تأثير وجود العينة وبدء
التحلل،حيثما ينطبق ذلك، على الأنسجة المحيطة (الشكل 1). تم إجراء تحليلات نسيجية
مرضيةوتحليلات سيتوكينية لكل عينة تحتوي على مقطع نسيجي. تم إدراج العدد
النهائيللعينات المدرجة للتحليل الإحصائي في النتائج. تم اعتبار الأعداد المقدرة
للحيواناتوالعينات لكل حيوان ضرورية للحصول على نتائج ذات دلالة إحصائية، كما
استنتجمن عملخورامروز وآخرون (2018).
2
ر.أهوجا وآخرون. اكتاهيستوتشيميكا 122 (2020) 151615
الشكل.1استراتيجية الزرع والتصميم التجريبي.
خلالالدراسة التجريبية، تم زرع خمس عينات من مادة التحكم في حيوانين لمدة
أسبوعلمراقبة استجابة الأنسجة وتطوير البروتوكول الجراحي، كما تم تقديمه في مكان آخر
بواسطةأهوجا وآخرون (2019).
يتمتجميد الأنسجة المتبقية في النيتروجين السائل وتخزينها عند درجة حرارة 80-◦
C لـ ELISA.
.2.4تحليل السيتوكين / اختبار الإنزيم
تمأخذ الأنسجة حول كل موقع زرع لتقدير السيتوكينات من الفئران في وقت
التضحيةوتخزينها عند 80-◦ج. علاوة على ذلك، تم تجانس أجزاء الأنسجة هذه في عازل
استخلاصالأنسجة (100 مليمولار 150 -7.8،PH Tris مليمولار 1 ،Nacl مليمولار 1 ،
يحتوي) EGTA، 1% Triton X 100,0.5% Sodium deoxycholate مليمولار EGTA
علىمثبط البروتياز بمساعدة مخُربِّ الأنسجة (Qiagen (باستخدام 5 ملجم من الأنسجة
و300ميكرولتر من عازل الاستخلاص. تم تقدير كمية -6IL وβ-1IL وα-TNF بواسطة
ELISA) BioTek، الولايات المتحدة الأمريكية) وفقاً لتعليمات الشركة المصنعة (D&R(.
تمتشغيل جميع العينات والمعايير في نسخ مكررة وتم حساب متوسطها. كان الارتباط
غيرالكامل للمستضدات، المعروف باسم التأثير المجمد، وعوامل التخفيف وإدراج أو
استبعادالعينة الوهمية بعض القضايا التي تم أخذها في الاعتبار في تحسين البروتوكول
لهذهالدراسة.
.2.3الإجراء الجراحي
بعدالصيام طوال الليل، تم إعطاء حقن داخل الصفاق من الكيتامين (~90 مجم /
كجم) والميدازولام (~5 مجم / كجم) لتخدير الحيوانات. تم تنظيف الذيل بمحلول
الإيثانولقبل الجراحة لتقليل التلوث البرازي. تم حلق المنطقة الظهرية للحيوانات
بمساعدةشفرة حلاقة وتعقيمها بمحلول إيثانول .٪70 باستخدام شفرة جراحية معقمة، تم
إجراءشق وإنشاء أكياس تحت الجلد على جانبي ظهر الفأر. تم إدخال غرسة في كل كيس.
بعدزرع البوليمر في الكيس، تم خياطة الشق باستخدام فيكريل 0-4 قابل للامتصاص (
إيثيكون). تم تعيين الحيوانات في مجموعة معينة بشكل عشوائي على الضابطة والشام
واثنينلكل من زرع عينة PLA و 5٪ PCL-PLA و 4٪ Mg-PLA. في نهاية كل نقطة زمنية (
8،2 أسابيع)، تم التضحية بالفئران عن طريق الاختناق في CO2غرفة ل≤2 دقيقة. تم
استئصالالغرسة والأنسجة المحيطة بها وتم سحب الدم عن طريق ثقب القلب؛ تم
تثبيتجزء من الأنسجة باستخدام بارافورمالدهيد مخزن بنسبة %4 (0.1 مول من محلول
الفوسفات،درجة حموضة 7.4) لمدة 10 دقائق. .2.5علم الأنسجة
تمغسل الأنسجة تحت الجلد المحتوية على العينة التي تم تثبيتها في ٪4
بارافورمالدهيد،وتجفيفها بدرجات تصاعدية (،٪70 ٪90 و ٪96) من الكحول، وتنقيتها في
الكلوروفورموالأسيتون ثم
الشكل.2(أ) صورة مجهرية ضوئية للقسم النسيجي الذي يحتوي على الحشوة الملطخة بالهيماتوكسيلين والإيوزين التي تم تصويرها تحت عدسة موضوعية x2) PLA في أسبوعين) تظُهر اختلافاً في سمك
الكبسولة؛(ب) صورة مجهرية ضوئية تمثيلية للقسم المزروع في 8 أسابيع تحتوي على عينة Mg PLA*) :إدراج) تم تصويره بسرعة x400 للتسجيل⃝ (
:تكوينالأوعية الدموية→:قياس الخلايا الالتهابية وسمك الكبسولة ([:(التغليف).
3
8 55.5(7.1) مقابل 54.3(8.1) (NS (55.5)7.1 (مقابل 59.2(4.7) (NS (54.3)8.1 (مقابل 59.2(4.7) (NS (تحليلالتباين ،6،0 ،6 5 55.9(7.5) مقابل 58.3(3.6) (NS (تحليلالتباين ،5،0 ،6 6 سمكالكبسولة_HE سمك_طن متري 7 كبسولة ،6،4 ،5 5 ،6،4 ،5 5 تحليلالتباين كروسكال-واليس 54.7(6.6) مقابل 58.3(3.6) (NS) (NS (0.26)1.08 مقابل 0.67(0.32) 0.8(0.3) مقابل 1.1(0.1) (NS ( (0.39)0.22 (مقابل 0.67(0.32) (NS (0.28)0.22 (مقابل 1.1(0.1) ص1/40.001 55.9(7.5) مقابل 54.7(6.6) (NS (ص1/40.001 0.39(0.22) مقابل 1.08(0.26) 0.28(0.22) مقابل 0.8(0.3) ص1/40.004 تكوينالأوعية الدموية الخلاياالبلعمية 56 ،6،4 ،5 5 ،7،9 ،9 9 تحليلالتباين كروسكال-واليس 0.0(4.0 مقابل 3.88(0.17) (NS (1148)210 (مقابل 934(254) (NS ( (2.7)1.2 (مقابل 4.0(0.0) ص1/40.037 205(147) مقابل 1148(210) ص1/40.001 0.0(0.0 مقابل 0.39(0.22) (NS (0.11)0.14 (مقابل 0.28(0.22) (NS ( (ص1/40.001 0.24(0.32) مقابل 2.7(1.2) 252(88) مقابل 205(147) (NS (الكرياتالبيضاء بيتا1IL 34 ،6،7 ،9 9 ،7،9 ،6 9 تحليلالتباين تحليلالتباين 154(473 مقابل 656(208) (NS (752)334 (مقابل 656(356) (NS ( (2.7)1.2 (مقابل 3.88(0.17) (NS (205)147 (مقابل 934(254) ص1/40.001 ص1/40.001 98.9(66.0) مقابل 656(208) 627(443) مقابل 656(356) (NS (98.9)66.0 (مقابل 473(154) ص1/40.001 627(443) مقابل 752(334) (NS (57)167 مقابل 98.9(66.0) (NS (286)195 (مقابل 627(443) (NS ( (تيإن فالفا ايال 6 12 المعلمة لاشيءضدجيش التحرير الشعبى الصينى جيشالتحرير الشعبى الصينىضدبلابلكل جيشالتحرير الشعبى الصينىضدبلامج بلابلكلضدبلامج اسمالاختبار PLAPCLو PLAMgو PLAو NIL في مجموعات s لاس.ب8 63.1(6.7) مقابل 64.1(13.3) (NS (63.1)6.7 (مقابل 60.6(6.6) (NS (64.1)13.3 (مقابل 60.6(6.6) (NS (تحليلالتباين ،5،0 ،6 6 65.5(12.7) مقابل 60.6(6.6) (NS (تحليلالتباين ،5،0 ،6 7 سمك_عالي_الكثافة كبسولة سماكة_MT 7 كبسولة تحليلالتباين ،5،4 ،6 5 63.7(6.1) مقابل 60.6(6.6) (NS (ص1/40.001 0.68(0.32) مقابل 0.03(0.07) ص1/40.001 6 تكوينالأوعية الدموية 0.04(0.07) مقابل 0.68(0.32) تحليلالتباين ،5،4 ،6 5 0.28(0.19) مقابل 0.03(0.07) (NS (ص1/40.001 0.70(0.18) مقابل 0.21(0.13) 63.7(6.1) مقابل 65.5(12.7) (NS (ص1/40.02 0.68(0.32) مقابل 0.28(0.19) ص1/40.001 5 الخلاياالبلعمية 0.21(0.18) مقابل 0.70(0.18) 3.29(0.35) مقابل 2.64(0.36) (NS (،5،4 ،6 5 0.21)0.18 (مقابل 0.21(0.13) (NS (ص1/40.002 3.83(0.26) مقابل 3.29(0.35) (NS (3.83)0.26 (مقابل 2.64(0.36) 0.04(0.07) مقابل 0.21(0.18) (NS (ص1/40.001 4 الكرياتالبيضاء 0.46(0.73) مقابل 3.83(0.26) ،5،4 ،8 7 ،6،2 ،5 7 تحليلالتباين واليس كروسكال- تحليلالتباين 154(308 مقابل 673(734) (NS (808)304 (مقابل 455(202) (NS ( (154)308 مقابل 686(122) (NS (808)304 (مقابل 570(461) (NS ( (بيتا1IL تيإن فالفا 23 تحليلالتباين ،6،3 ،8 7 122(686 مقابل 673(734) (NS (570)461 (مقابل 455(202) (NS ( (ص1/40.038 1192(248) مقابل 1373(255) (NS (1192)248 (مقابل 963(322) (NS (1373)255 (مقابل 963(322) 31(166 مقابل 308(154) (NS (594)233 (مقابل 808(304) (NS ( (ص1/40.006 1 ايال 6 472(118) مقابل 1192(248) مجموعاتs المعلمة لاشيءضدجيش التحرير الشعبى الصينى جيشالتحرير الشعبى الصينىضدبلابلكل جيشالتحرير الشعبى الصينىضدبلامج بلابلكلضدبلامج اسمالاختبار PLAPCLو PLAMgو PLAو NIL في لاس. أجميعمتغيرات الدراسة كدالة للمجموعات، بما في ذلك أهمية المقارنات بين المجموعات، والاختبارات الإحصائية المستخدمة وعدد العينات (س) تم تحليلها في (أ) بعد أسبوعين و (ب) بعد 8 أسابيع. الجدول1 4 151615 ) 2020 ( 122 هيستوتشيميكا اكتا وآخرون. أهوجا ر.
ر.أهوجا وآخرون. اكتاهيستوتشيميكا 122 (2020) 151615
تمدمجها في بارابلاست. تم تقطيع كتل الأنسجة بسمك 10-7 ميكرومتر وتم تعويم
المقاطعوأخذها على شرائح زجاجية نظيفة مطلية بألبومين البيض. تم الحصول على
ستةمقاطع على الأقل لكل نسيج لكل حيوان. ثم تم صبغ المقاطع بالهيماتوكسيلين
والإيوزين(للتحليل المورفولوجي للخلايا الالتهابية) بالإضافة إلى شعيرات ماسون (لتحليل
الأنسجةالليفية) وتثبيتها باستخدام DPX. تمت ملاحظة المقاطع تحت تكبير عالي (X400
) باستخدام مجهر ضوئي (61BX Olympus(.
تمتصوير المناطق الرئيسية التي تظهر الاستجابات الالتهابية في المنطقة المحيطة
بالزرع.تم فحص المقاطع الملطخة بالهيماتوكسيلين والإيوزين تحت المجهر، وتم إخفاء
هويةالحيوان الممثل على الشريحة لحساب الخلايا البلعمية وتكوين الأوعية الدموية. تم
اختيارحقل العد الأول عشوائياً وتم إجراء العد من اليمين إلى اليسار، ثم لأعلى، ثم من
اليسارإلى اليمين ثم لأسفل باستخدام برنامج محقق الاستريو (Bioscience MBF،
الولاياتالمتحدة الأمريكية) (كور وآخرون، 2018). تم حساب متوسط عدد الخلايا
الالتهابيةتحت هدف X40 من ما يصل إلى 14 حقلاً. تم تكييف التسجيل للتحليل
الهيستومورفومتريمننيسبيت وآخرون (2010)و أغباجي وآخرون (2018).
تعتبرالكريات البيضاء أنها تشمل جميع الخلايا الالتهابية العدلات والوحيدات
والكرياتالبيضاء، باستثناء الخلايا البلعمية. تم تصنيف التسلل عبر مجال الرؤية على أنه
عرضيأو بؤري أو منتشر. تم تصنيف الاندماج أيضاً بشكل منفصل على أنه انتقال إلى
الخلاياالبلعمية. تم تحديد الخلايا البلعمية من خلال نواة متعددة الفصوص وشكل غير
منتظم.يتم التعرف على خلايا الدم الحمراء المحاطة بالخلايا البطانية على أنها خلايا دم
جديدةوبالتالي يتم تسجيلها في تكوين الأوعية الدموية (الشكل 2
(ب)). تم استخدام العدد لكل مجال عالي الطاقة كمعيار لتسجيل الخلايا البلعمية وتكوين
الأوعيةالدموية.
تمملاحظة أقسام الأنسجة الملطخة بـ E&H وثلاثي ألوان ماسون تحت المجهر
الضوئي61BX Olympus باستخدام عدسة موضوعية X.40 بعد صبغ E&H، تم إعادة
صبغأقسام الأنسجة بثلاثي ألوان ماسون وفحصها تحت عدسة موضوعية X.2 لم يتم
توزيعالأنسجة الكبسولية بالتساوي، حيث تم ترتيب بعض المناطق بشكل فضفاض
وتكديسمناطق أخرى بإحكام مما أدى إلى اختلاف في السمُك حول الحشوة، كما يتضح
فيالشكل 2(أ). وبالتالي، تم التقاط الصور على فترات 60 درجة حول محيط الإدخال (
حتى6 صور لكل مقطع) تحت مجال عالي القدرة (عدسة موضوعية X40 (لإجراء قياسات
نهائيةمتعددة. تم قياس سمك الكبسولة باستخدام برنامج )i1.50 )J Image. تضمنت
عمليةالقياس أولا ًمعايرة شريط المقياس (50 ميكرومتر) الذي تم إدخاله في الصورة ثم
أخذثلاثة قياسات مختلفة للكبسولة في أماكن مختلفة في نفس الصورة باستخدام خط
الكنتوروحساب متوسط سمك الكبسولة. لوحظ تنظيم الكولاجين في منطقة القياس.
.2.6عرض البيانات والتحليل الإحصائي
تمالتعامل مع مستويات السيتوكين والنتائج النسيجية وسمك الكبسولة كمتغيرات
مستمرة.يتم تقديم البيانات التي تم الحصول عليها لجميع المعلمات كمتوسط (انحراف
معياري). تم استخدام تحليل التباين (أو كروسكال واليس، إذا كان التوزيع غير طبيعي)
لمقارنةالمتغيرات الكيميائية الحيوية أو النسيجية في أربع مجموعات (NIL وPLA وMg
PLA وPCL PLA(. تم استخدام HSD-Tukey للاختبار اللاحق المصحح للتعددية
للمقارناتالزوجية. تم إجراء التحليل الإحصائي باستخدام Python) الإصدار 3.7.3) مع
Scipy) الإصدار 1.4.1) وStatsmodels) الإصدار 0.11.1) وحزم أخرى. تم اعتبار القيم P
الأقلمن 0.05 ذات دلالة إحصائية.
الشكل.3رسوم بيانية تمثيلية من دراسة تحليل كبسولة حول الغرسة لـ أ) -6IL، ب) Beta-1IL، ج) سمك الكبسولة، كما تم قياسه بواسطة مقاطع مصبوغة بـ )MT_Cap )Trichome s'Masson و د) سمك
الكبسولةكما تم قياسه بواسطة مقاطع مصبوغة بالهيماتوكسيلين والإيوزين (HE_Cap(؛ مع عدد العينات التي تم تحليلها (أشرطة الخطأ: 1.5)×المدى الربعي).
5
ر.أهوجا وآخرون. اكتاهيستوتشيميكا 122 (2020) 151615
الشكل.4صور مجهرية تمثيلية للمقاطع النسيجية بعد أسبوعين، تحتوي على عينات PLA ملطخة بـ Trichome s'Masson تم تصويرها تحت عدسة موضوعية B ،x10( A (و x،40 و Eosin & Hematoxylin
.10x، )D( 40x (C)تحت
.3النتائج أعلىدرجة في الكريات البيضاء مقارنة بالمجموعة NIL في هذه النقطة الزمنية.
فيالأسبوعين الثانيين، كان لكل من Mg PLA وPCL PLA تكوين أوعية دموية أقل
بشكلملحوظ من PLA. وبحلول الأسبوع الثامن، كان لدى أقسام PCL PLA عدد أكبر من
البراعمالوعائية مقارنة بتلك التي تحتوي على PLA. زاد تكوين الأوعية الدموية في PLA
مقارنةبـ NIL بشكل ملحوظ في نقطة زمنية مدتها أسبوعان.
يتمتوزيع الخلايا الالتهابية (نوى أرجوانية ذات أحجام مختلفة وعدد من الفصوص)
علىكامل منطقة المحفظة بعد أسبوعين، على الرغم من أنها تبدو أكثر تركيزاً نحو الفراغ،
حيثكانت العينة موجودة، بالنسبة لـ PLA) الشكل 4). بحلول الأسبوع الثامن، تتميز
الكبسولةبمنطقة مكتظة بالخلايا الالتهابية المحيطة بالعينة مباشرة (الشكل 5). تم
بالفعلملاحظة تكوين الكبسولة المنظمة بعد مرور أسبوعين (الشكل 4). بشكل عام،
يتناقصتنظيم حزم الكولاجين المخططة مع تناقص المسافة من الفراغ. يرُى اتجاه مماثل
فيأقسام Trichome s'Masson المصبوغة، على الرغم من أن الحزم المعبأة بشكل
فضفاض،المصبوغة باللون الأخضر، تبدو وكأنها تشغل منطقة أكبر في الكبسولة عند 8
أسابيع(الشكل 5). يمكن رؤية تنظيم الكولاجين الناضج في الأسبوع الثامن، ويتم تحديده
منخلال المناطق المخططة لحزم الكولاجين (الشكل 5). داخل الكبسولات، تظهر ثلاث
مناطقرئيسية في هذه المرحلة - قسم أوسط كثيف في الكبسولة، مع عدد أقل من
الخلايا،ومساحة كبيرة بين هذه الطبقة والظهارة المتكونة وفي المنطقة الخارجية، الخلايا
الليفيةالتي تشكل الكولاجين الجديد مع هامش مميز أبعد من ذلك.
لميكن هناك فرق كبير بين سمك الكبسولة حول جميع مواد الزرع عند الأسبوعين
الثانيوالثامن، كما تم قياسه بالطريقتين (الجدول 1).
.3.1النتائج العيانية
وقدنسُب موت حيوان واحد بعد الجراحة مباشرة إلى التخدير غير المناسب. وقد زاد
وزنجميع الحيوانات على مدار مدة الدراسة عن الوزن المقاس قبل الجراحة (الشكلان 1S
و2S(. وقد لوحظ ارتباط الشعر بالأنسجة الملتئمة لجميع العينات المستأصلة بعد 8
أسابيع.كما لوحظ نمو الشعر فوق الأنسجة الملتئمة في جميع الحيوانات قبل التضحية.
.3.2الاختبارات الكيميائية الحيوية
تمزيادة مستوى أنسجة α-TNF في Mg PLA مقارنة ًبـ PLA، وإن لم يكن بشكل
ملحوظ،بعد أسبوعين ولكن بعد 8 أسابيع زاد مقارنة ًبـ PLA) الجدول 1). أظهرت PCL-
PLA زيادة كبيرة فيما يتعلق بـ PLA فقط بحلول 8 أسابيع. لم تظهر مجموعات PLA و
NIL أي اختلافات كبيرة في كلتا النقطتين الزمنيتين. بعد أسبوعين، كان مستوى 6IL
المتزايدمهماً في مجموعة PLA مقارنة ًبـ NIL وPCL PLA مقارنة ًبـ Mg PLA) الشكل 3).
لمتكن الاختلافات بين المجموعات في مستوى أنسجة -6IL ذات دلالة إحصائية عند 8
أسابيعلجميع المقارنات (الجدول 1( في 8 أسابيع PLA أعلى بشكل ملحوظ من β-1IL
.(3 الشكل). PLA PCL وPLA Mg لديهمامستوى
.3.3علم الأنسجة
فيالأسبوع الثاني، أظهرت أقسام الأنسجة التي تحتوي على PLA درجات كريات الدم
البيضاءأعلى بشكل ملحوظ من تلك التي تحتوي على Mg PLA. كانت درجة كريات الدم
البيضاءأعلى من الأنسجة من مجموعة NIL للأنسجة التي تحتوي على PLA في الأسبوع
الثاني،وكان لدى PCL-PLA عدد أكبر من الخلايا البلعمية مقارنة بـ PLA وMg-PLA.
فيالأسبوع الثامن، أظهرت كلتا المادتين المعدلتين زيادة في تسلل الخلايا البلعمية
مقارنةبـ PLA. كما كان لـ PCL PLA درجة أعلى في الكريات البيضاء من PLA. لم تكن
الاختلافاتبين الكريات البيضاء والخلايا البلعمية في المواد المعدلة كبيرة. تلقى PLA
زيادةكبيرة في تسلل الخلايا البلعمية.
.4المناقشة
فيهذا العمل، تم زرع أقسام من الأنابيب المعدة لتصنيع الدعامة، ولكن لم يتم
قطعهابعد إلى تصميم الدعامة، تحت الجلد في ظهر الفئران؛ تم استخدام وجود الكريات
البيضاءوالبلعميات وتكوين الأوعية الدموية كدليل على استجابة الأنسجة وتم تحديد كمية
السيتوكيناتالالتهابية الحادة التي تعتبر عموماً -6IL وα-TNF وβ-1IL من كبسولة الزرع
المحيطة.
6
ر.أهوجا وآخرون. اكتاهيستوتشيميكا 122 (2020) 151615
فيالسابق، لم يظُهرِ يون وآخرون أي تغيير في الالتهاب في منطقة الأنسجة التي
تلامسPLLA، على مدار دراسة استمرت 180 يوماً (يون وآخرون، 2017). بالتوافق مع
هذهالنتيجة، لم يرتفع مستوى أنسجة α-TNF وβ-1IL و-6IL في مجموعة PLA حتى
بالمقارنةمع مجموعة NIL، في جميع نقاط الوقت باستثناء -6IL عند أسبوعين. هذا
الاكتشافيدعم بقوة التفضيل المستمر لاستخدام PLA كمادة حيوية فوق جميع المواد
المتاحةتجاريا.ً ومع ذلك، في الأقسام التي تحتوي على PLA، نضجت الكريات البيضاء
بشكلمتزايد واندمجت عند أسبوعين حتى بالمقارنة مع Mg PLA. قد يشير هذا إلى
تقدمأسرع على طول سلسلة الشفاء لـ PLA، ولكن أيضا،ً نظراً لأن α-TNF مرتبط
بتنشيطالكريات البيضاء، على الرغم من أن الاختلاف لم يكن مهما،ً فإن المستوى
النسيجيالأعلى لهذا السيتوكين مقارنة ًبكل من PCL PLA وMg PLA بالتزامن مع درجة
الكرياتالبيضاء الأعلى بشكل ملحوظ في PLA مقابل Mg PLA، قد يكون اكتشافاً
يستحقالاستكشاف (الجدول 1) (كاستيلانو وآخرون، 2014). يمكن افتراض أن الالتهاب
المنخفضفي الفترة الأولية التي تلي الزرع يكون أكثر فائدة حيث يتشكل الغطاء البطاني
ببطءمما يجعل الجسم أكثر عرضة لتفاعل مناعي سلبي (هوراكوفا وآخرون، 2018).
قديوفر بدء التحلل غير المنتظم للمكونات مبرراً لارتفاع مستوى α-TNF في Mg PLA
مقارنةبكل من المواد الأخرى، على الرغم من أهميته فقط فيما يتعلق بـ PLA، بحلول 8
أسابيع.بشكل عام، قد يؤدي انخفاض الاستجابة الالتهابية بسبب تحييد منتجات التحلل
الحمضيةلـ PLA بواسطة )OH )Mg الأساسي إلى انخفاض في الاستجابة الالتهابية
بسببتحييد منتجات التحلل الحمضية لـ PLA بواسطة )OH )Mg الأساسي2.وما إلى
ذلكقد يكون متوقعاً (راموت وآخرون، 2016في هذه الدراسة، ربما يكون Mg-PLA قد
زادمن تسلل الخلايا البلعمية مقابل PLA، بسبب التحلل المفاجئ للجسيمات عند أو
حوالي8 أسابيع، مما يشير إلى الحاجة إلى تقليل حجم الجسيمات واستكشاف عوامل
التوافق(إمري وبوكانسزكي، 2013). يمكن أيضاً حساب الخلايا لكل مليمتر،2 كما هو
الحالمعيون وآخرون (2017)، أو منطقة مربعة وسيطة مختلفة ذات صلة بالشوائب
الماديةلإثبات علاقة مع تدهور الغرسة. ومع ذلك، من المتوقع حدوث زيادة مقابلة في
الخلاياالبلعمية عند زيادة تنظيم α-TNF) مارتن وليبوفيتش، 2005). تم ربط α-TNF و-6
IL أيضاً بتكوين الخلايا الظهارية والخلايا التائية والخلايا البائية (الخلايا الليمفاوية
الصغيرةوالكبيرة) على التوالي، مما دفع إلى إجراء تحقيق أكثر تحديداً في أنواع الكريات
البيضاءالمسجلة والعلامات مثل 68CD لـ
الخلاياالبلعمية، في المستقبل، لفهم أكثر دقة للتأثير الالتهابي لتعديل البوليمر هذا (
بنيهودوآخرون، 2007؛جي وآخرون، 2012).
أظهرتالأنسجة زيادة في مستوى β-1IL في PCL PLA مقارنة بـ PLA في 8 أسابيع.
الطبيعةالبطيئة لتحلل PCLفي الجسم الحيقد يكون هذا قد أدى إلى زيادة نشاط الخلايا
البلعمية،فضلا ًعن التعبير عن β-1IL وα-TNF في هذه الدراسة. وقد نسُبت خاصية
التحللهذه إلى الكراهية النسبية للماء لـ PCL) وهي أيضاً وظيفة للوزن الجزيئي للبوليمر)
وتمتعديلها وفقاً لذلك أيضا،ً من خلال دمج مجموعات محبة للماء والتي يمكن أن تؤثر
أيضاًعلى ارتباط الخلايا (جونغ وآخرون، 2004؛ كرودر وآخرون، 2009). بشكل عام، داخل
الجسم،تميل البلورة والتحلل إلى أن يكون لهما علاقة تناسب عكسي؛ أي أن المناطق
ذاتالبلورة المنخفضة تخضع للتحلل بشكل أسرع. لم تكن الكريات البيضاء في الأنسجة
المحتويةعلى PLA وPCL-PLA قابلة للمقارنة بحلول 8 أسابيع، بناء ًعلى تقدير الطبيعة
الأكثرحمضية نسبياً لمنتجات تحلل PLA والتي تكون أكثر حساسية لدرجة الحموضة
المنخفضةللبيئة مقارنة بتلك الموجودة في PCL) سكافارو وآخرون، 2017يمكن أن
تعُزىهذه النتائج إلى الارتفاع الأولي في الالتهابات مع بدء التحلل في هذه النقطة
الزمنيةأو يتم رفضها بسبب العدوى المحتملة نحو نهاية التجربة والتي يمكن القضاء
عليهامن خلال دراسة موسعة مستقبلية مع المزيد من الحيوانات وتأكيدفي الجسم الحي
تدهورالزرع (بانكاجاكشان وآخرون، 2008بحلول الأسبوع الثامن، لم يكن عدد الخلايا
البلعميةوكريات الدم البيضاء الناجم عن إضافة PCL مختلفاً بشكل كبير مقارنة
بالمغنيسيوم،مما يشير إلى أن التعديلات على PLA أقل من نسبة صغيرة معينة من
حيثالوزن قد يكون لها تأثير التهابي مكافئ.
فيحين أن -6IL هو عامل التهابي بحت، فقد تم ربط α-TNF وβ-1IL بالخلايا الليفية
(راموت وآخرون، 2016). ومع ذلك، لم يلاُحظ أي تأثير كبير لمستويات السيتوكين
المرتفعةعلى سماكة الكبسولة المحسوبة للمواد المعدلة، مما يستدعي وضع علامات
نسيجيةأكثر دقة على الخلايا الليفية ومرحلة تخليق الكولاجين التي يمكن تمييزها في
الكبسولةلفهم الآليات. يمكن إجراء ELISA و Immunohistochemistry مع المؤشرات
الحيويةذات الصلة لمزيد من توصيف نوع الكولاجين الموجود (ستانتون وآخرون، 2019).
متوسط
الشكل.5صور مجهرية ضوئية لمقاطع نسيجية تحتوي على عينات PCL PLA تم استئصالها عند 8 أسابيع ملطخة بـ Trichome s'Masson تم تصويرها تحت عدسة موضوعية B ،x10( A (وx،40 وEosin&
.10x، )D( 40x (C) تحت Hematoxylin
7
ر.أهوجا وآخرون. اكتاهيستوتشيميكا 122 (2020) 151615
كانسمك الكبسولة عبر جميع المواد القائمة على حمض البوليكتيك المدروسة حوالي
60ميكرومتر. ويبقى أن نستنتج ما إذا كان من المرغوب أن يكون سمك الكبسولة أكثر أو
ببساطةيفضل كبسولة أكثر قوة لنجاح الدعامة. والمسألة الأخرى المثيرة للجدل هي ما إذا
كانيجب تقليلها بمرور الوقت لتقليل خطر الإصابة بالجلطات، مع المساس بسلامة بنية
الدعامةالداخلية. يمكن أن يكون تكوين الكبسولة الليفية في البيئة تحت الجلد مفيداً في
تحديدتكوين بطانة جديدة بعد زرع الأنبوب / الدعامة في جدار الشريان. يبلغ سمك
الكبسولةنصف سمك الأنبوب نفسه تقريبا،ً مما يساهم في بروز الدعامة بشكل عام
وطبقةبطانة الأوعية الدموية التي تغطيها في تجويف الشريان (كلوين وآخرون، 2017).
إنإقامة علاقة بين سمك الكبسولة تحت الجلد وإمكانية تكوين بطانة الأوعية الدموية
لمادةما قد يكون مفيداً لاختبار الفرضيات القائمة على هذا الاهتمام، ويمكن العمل على
ذلكمن خلال الدعامات في نموذج الحيوان الكبير ذي الصلة (