Lakhasly

تم تقييم مستويات بروتين mTOR والشكل المُفسفر منه (p-mTOR) باستخدام تقنية Western blot. تم استخلاص البروتينات الكلية من الخلايا باستخدام محلول تحلل يحتوي على مثبطات البروتياز والفوسفاتاز، تم تحديد تركيز البروتين باستخدام اختبار BCA لضمان توحيد كمية البروتين المحملة في كل بئر. تم فصل كميات متساوية من البروتينات باستخدام الرحلان الكهربائي على هلام بولي أكريلاميد بوجود SDS (SDS-PAGE)، ثم نُقلت البروتينات المفصولة إلى غشاء PVDF باستخدام نظام النقل الكهربائي. تم الكشف عن الإشارات البروتينية باستخدام نظام التألق الكيميائي المحسن (ECL)، حيث ظهرت الحزم البروتينية وتم توثيقها باستخدام جهاز تصوير مناسب. تم تحليل كثافة الحزم باستخدام برنامج تحليل صور، وتمت معايرة التعبير البروتيني بالنسبة إلى بروتين مرجعي ثابت مثل β-actin، حيث عُبر عن النتائج كنسبة بين البروتين الهدف والبروتين المرجعي،

تم تقييم مستويات بروتين mTOR والشكل المُفسفر منه (p-mTOR) باستخدام تقنية Western blot. في البداية، تم استخلاص البروتينات الكلية من الخلايا باستخدام محلول تحلل يحتوي على مثبطات البروتياز والفوسفاتاز، وذلك للحفاظ على سلامة البروتينات ومنع تحللها أو إزالة الفسفرة. بعد ذلك، تم تحديد تركيز البروتين باستخدام اختبار BCA لضمان توحيد كمية البروتين المحملة في كل بئر.

تم فصل كميات متساوية من البروتينات باستخدام الرحلان الكهربائي على هلام بولي أكريلاميد بوجود SDS (SDS-PAGE)، ثم نُقلت البروتينات المفصولة إلى غشاء PVDF باستخدام نظام النقل الكهربائي. بعد ذلك، خضع الغشاء لعملية الحجب باستخدام محلول يحتوي على 5% من الحليب الخالي من الدسم في محلول TBS-T بهدف تقليل الارتباط غير النوعي.

تمت حضانة الأغشية مع الأجسام المضادة الأولية الخاصة بـ mTOR وp-mTOR عند درجة حرارة 4°C طوال الليل، ثم غُسلت وأُعيدت حضانتها مع الأجسام المضادة الثانوية المرتبطة بإنزيم HRP. بعد ذلك، تم الكشف عن الإشارات البروتينية باستخدام نظام التألق الكيميائي المحسن (ECL)، حيث ظهرت الحزم البروتينية وتم توثيقها باستخدام جهاز تصوير مناسب.

في النهاية، تم تحليل كثافة الحزم باستخدام برنامج تحليل صور، وتمت معايرة التعبير البروتيني بالنسبة إلى بروتين مرجعي ثابت مثل β-actin، حيث عُبر عن النتائج كنسبة بين البروتين الهدف والبروتين المرجعي، إضافة إلى نسبة p-mTOR/mTOR لتقييم مستوى تنشيط المسار.