Lakhasly

تبدأ عملية تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) باستخلاص عينة صغيرة من الحمض النووي، تتكون العملية من ثلاث مراحل رئيسية: التمسخ، يُسخّن الحمض النووي إلى 95 درجة مئوية لكسر الروابط الهيدروجينية بين أزواج القواعد المتكاملة في الجزيء ثنائي السلسلة. حيث يُبرّد الحمض النووي المتمسخ إلى درجة حرارة تتراوح عادةً بين 55 و72 درجة مئوية، مما يسمح للبادئات بالارتباط بتسلسلاتها المتكاملة. يكون التهجين أكثر فعالية عند درجة حرارة تتراوح بين 55 و72 درجة مئوية. يتراوح طول البادئات عادةً بين 20 و25 نيوكليوتيدًا. خلال مرحلة التهجين، ترتبط البادئات بالتسلسلات المتكاملة على الحمض النووي أحادي السلسلة عن طريق اقتران نهاياتها 3′ مع السلسلة القالب، يُمكّن هذا التفاعل من تخليق الحمض النووي المزدوج خلال مرحلة الاستطالة. وتُستخدم في المرحلة النهائية درجة حرارة تتراوح بين 75 و80 درجة مئوية لتحسين نشاط إنزيم بوليميراز الحمض النووي وتعزيز استطالة السلسلة. يحتاج إنزيم بوليميراز الحمض النووي إلى بادئ مُرتبط بالحمض النووي أحادي السلسلة لبدء تخليق السلسلة. تُكرَّر هذه العملية باستخدام جهاز التدوير الحراري، وهو جهاز يُنظِّم درجة الحرارة ومدة كل خطوة في الدورة. بما في ذلك تراكم جزيئات البيروفوسفات، يُمكن لبروتينيز K أن يُثبط تفاعل PCR عن طريق تحليل بوليميراز الحمض النووي (DNA polymerase) والبروتينات الأساسية الأخرى إذا لم تتم إزالته بشكل كافٍ أثناء تحضير العينة. يُمكن تنقية قوالب الحمض النووي (DNA) عن طريق الغسيل الكلوي أو الترسيب بالإيثانول. تشمل طرق التنقية الإضافية الاستخلاص بالكلوروفورم والكروماتوغرافيا. 5] يُجرى عادةً الفصل الكهربائي على هلام الأغاروز مع تلوين بروميد الإيثيديوم لتصوير الحمض النووي. يُمكن نقل الحمض النووي (DNA) إلى غشاء وفحصه، عادةً ما تُحصل النتائج في غضون ساعات قليلة، بينما قد تستغرق العمليات المطولة ما يصل إلى ثلاثة أيام. غالبًا ما تكفي كمية ضئيلة من الحمض النووي (DNA) أو الحمض النووي الريبي (RNA) تتراوح بين 1 و100 نانوغرام لبدء التفاعل، مع العلم أن بعض التحليلات عالية الحساسية قد تستخدم كميات أقل.

تبدأ عملية تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) باستخلاص عينة صغيرة من الحمض النووي، عادةً DNA أو RNA، ووضعها في أنبوب تفاعل. تتكون العملية من ثلاث مراحل رئيسية: التمسخ، والتهجين، والاستطالة. خلال مرحلة التمسخ، يُسخّن الحمض النووي إلى 95 درجة مئوية لكسر الروابط الهيدروجينية بين أزواج القواعد المتكاملة في الجزيء ثنائي السلسلة. يلي ذلك مباشرةً مرحلة التهجين، حيث يُبرّد الحمض النووي المتمسخ إلى درجة حرارة تتراوح عادةً بين 55 و72 درجة مئوية، مما يسمح للبادئات بالارتباط بتسلسلاتها المتكاملة. يكون التهجين أكثر فعالية عند درجة حرارة تتراوح بين 55 و72 درجة مئوية.

تعتمد درجة حرارة التهجين المثلى على الخصائص الفيزيائية والكيميائية للبادئات في المحلول. يتراوح طول البادئات عادةً بين 20 و25 نيوكليوتيدًا. خلال مرحلة التهجين، ترتبط البادئات بالتسلسلات المتكاملة على الحمض النووي أحادي السلسلة عن طريق اقتران نهاياتها 3′ مع السلسلة القالب، مما يوفر نقطة بداية لتخليق الحمض النووي. يُمكّن هذا التفاعل من تخليق الحمض النووي المزدوج خلال مرحلة الاستطالة. وتُستخدم في المرحلة النهائية درجة حرارة تتراوح بين 75 و80 درجة مئوية لتحسين نشاط إنزيم بوليميراز الحمض النووي وتعزيز استطالة السلسلة.

يحتاج إنزيم بوليميراز الحمض النووي إلى بادئ مُرتبط بالحمض النووي أحادي السلسلة لبدء تخليق السلسلة. يقوم الإنزيم بتخليق سلاسل جديدة في الاتجاه من 5′ إلى 3′، مُولِّدًا تسلسلات مُكمِّلة للسلاسل القالب. تُكرَّر هذه العملية باستخدام جهاز التدوير الحراري، وهو جهاز يُنظِّم درجة الحرارة ومدة كل خطوة في الدورة. يؤدي التكرار إلى تضخيم نسخ متعددة من الحمض النووي المستهدف داخل الأنبوب. تنخفض كفاءة التضخيم بعد 30 إلى 40 دورة بسبب استنفاد الكواشف، وتراكم النواتج الثانوية، وانخفاض نشاط الإنزيم، وتنافس الناتج مع القالب، بما في ذلك تراكم جزيئات البيروفوسفات، والارتباط الذاتي المُفرط، ووجود مُثبِّطات تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR). تشمل مثبطات تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) بروتينيز K، والفينول، و EDTA.

يُمكن لبروتينيز K أن يُثبط تفاعل PCR عن طريق تحليل بوليميراز الحمض النووي (DNA polymerase) والبروتينات الأساسية الأخرى إذا لم تتم إزالته بشكل كافٍ أثناء تحضير العينة. تشمل المواد الأخرى التي تؤثر سلبًا على تفاعل PCR المنظفات الأيونية، والهيبارين، والسبيرميدين، والهيموجلوبين. كما يُمكن أن يُعطل بروموفينول الأزرق وزيلين سيانول تفاعلات PCR. وللحد من هذه التأثيرات، يُمكن تنقية قوالب الحمض النووي (DNA) عن طريق الغسيل الكلوي أو الترسيب بالإيثانول. تشمل طرق التنقية الإضافية الاستخلاص بالكلوروفورم والكروماتوغرافيا.[5]

بعد تضخيم الحمض النووي (DNA) باستخدام تفاعل PCR، يُجرى عادةً الفصل الكهربائي على هلام الأغاروز مع تلوين بروميد الإيثيديوم لتصوير الحمض النووي. يُفحص الهلام تحت الأشعة فوق البنفسجية. وللتحقق من خصوصية النتائج وتقليل التضخيم غير النوعي، مثل ثنائيات البادئات، يُمكن نقل الحمض النووي (DNA) إلى غشاء وفحصه، كما هو الحال في تهجين ساوثرن بلوت.

يُوفر تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) العديد من المزايا في العلوم الأساسية والطبية الحيوية. وقد أصبح هذا الأسلوب المعيار الذهبي للعديد من التطبيقات نظرًا لسرعته وحساسيته وموثوقيته. عادةً ما تُحصل النتائج في غضون ساعات قليلة، بينما قد تستغرق العمليات المطولة ما يصل إلى ثلاثة أيام. غالبًا ما تكفي كمية ضئيلة من الحمض النووي (DNA) أو الحمض النووي الريبي (RNA) تتراوح بين 1 و100 نانوغرام لبدء التفاعل، مع العلم أن بعض التحليلات عالية الحساسية قد تستخدم كميات أقل. يستطيع تفاعل البوليميراز المتسلسل تضخيم ما بين 10⁶ و10⁹ نسخة من الحمض النووي في وقت قصير. كما يُتيح دمج مواقع التقييد في النهايات الطرفية استنساخًا فعالًا وتعبيرًا عن نواتج التضخيم.