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Contrôle cotraductionnel de la transposition d'IS911

Ce texte explore le contrôle cotraductionnel de la transposition de l'élément d'insertion IS911. L'étude se concentre sur l'influence de la transposase OrfAB sur la transposition.

Résultats principaux:

• Une réduction du décalage du cadre de lecture (et donc une augmentation de la pause ribosomique) favorise spécifiquement la liaison cotraductionnelle d'OrfAB au site d'insertion (cis).
• L'éloignement d'OrfAB par rapport à son site d'insertion cible réduit l'activité de transposition, suggérant que la liaison cotraductionnelle est nécessaire pour l'efficacité.
• La liaison d'OrfAB au site d'insertion est inhibée par sa région C-terminale, ce qui suggère que le repliement de cette région masque les résidus N-terminaux impliqués dans la liaison.
• La présentation du ribosome permet à OrfAB de se lier au site d'insertion tout en étant encore attaché au ribosome, ce qui met en évidence la nature cotraductionnelle de la liaison.

Méthodes:

• Des mutations ont été introduites dans le gène OrfAB pour modifier la pause ribosomique.
• Des tests de croisement in vivo ont été utilisés pour mesurer l'activité de transposition dans différentes configurations (cis et trans).
• Des expériences d'électrophorèse de mobilité lente (EMSA) ont été réalisées pour étudier la liaison d'OrfAB aux sites d'insertion.
• Une approche de « présentation du ribosome » a été utilisée pour étudier la liaison d'OrfAB au site d'insertion en présence de ribosomes.

Conclusions:

L'étude révèle un contrôle cotraductionnel de la transposition d'IS911, où la liaison d'OrfAB au site d'insertion est optimisée par la pause ribosomique et la présentation de la protéine naissante depuis le ribosome. Cette liaison est inhibée par le repliement de la région C-terminale d'OrfAB. Ces résultats mettent en évidence l'importance de la liaison cotraductionnelle pour l'efficacité de la transposition.

Cellule moléculaire
Contrôle cotraductionnel de la transposition
UN Les mutations n'affectent pas les niveaux ou l'activité d'OrfAB. Cependant, une
diminution significative d'environ 160 fois a été observéecis (comparerChiffres
2Bii et 2Biv). Ces résultats impliquent une réduction des niveaux de décalage
du cadre de lecture et, par inférence, la pause ribosomique améliore
spécifiquement lacispréférence vraisemblablement en facilitant la liaison
cotraductionnelle danscis.
Effet de la distance entreorfABet les IR
Une prédiction du modèle de liaison cotraductionnelle est que
l'éloignement du gène Tpase de ses IR cibles devrait entraîner une
réduction de l'activité de transposition (Derbyshire et al., 1987). Nous
avons testé cela en utilisant trois plasmides dans lesquelsorfABse situe à
l'extérieur du transposon à une distance de 372, 3078 ou 5306 pb de l'IRL
proximal. La transposition est un peu plus faible que lorsque OrfAB fait
partie intégrante de l'IS (comparerFigure 2Ci avecFigure 2Bii) mais est
encore réduite d'un facteur compris entre 10 et 30 fois sur cette gamme
de distances (Chiffres 2Cii et 2Ciii).
B
Liaison cotraductionnelle des dérivés naissants d'OrfAB :
présentation des ribosomes
L'inefficacité de la liaison OrfAB est illustrée par EMSA (Figure 3). Un
fragment porteur d'IRR marqué à l'extrémité de 100 pb (voie 1) a été
mélangé avec OrfAB[1-149], un dérivé conservant les 149 premiers
résidus N-terminaux d'OrfAB (voie 2) ou OrfAB pleine longueur (voie 3).
L'OrfAB pleine longueur se lie mal à l'IRR (Normand et al., 2001). Les
préparations sont souvent contaminées par des peptides ne comprenant
que des segments N-terminaux dont la liaison génère les espèces
étiquetées ''**'' (Haren et al., 2000). Les bandes supérieures pâles (*)
peuvent représenter de faibles niveaux de vrais complexes synaptiques
OrfAB. OrfAB[1-149] se lie plus avidement, générant deux espèces
principales, SCI et SCII. L'extrémité C-ter d'OrfAB a clairement inhibé la
liaison. Une explication est que le domaine de liaison à l'ADN N-terminal
se replie correctement avant la traduction de la protéine entière et que le
repliement de l'extrémité C-ter masque les résidus N-terminaux
impliqués dans la liaison à l'ADN.
Pour tester si OrfAB se lie tout en étant encore attaché au ribosome,
nous avons utilisé une approche de « présentation du ribosome » (
Fedorov et Baldwin, 1995) dans un coupléEscherichia coli-système de
transcription-traduction dérivé avecorfABfragments de gènes dépourvus
de codon de terminaison. La dissociation du ribosome est bloquée sur
l'ARNm résultant, laissant l'extrémité N s'étendant à partir du canal de
sortie du ribosome. Nous avons étudié le comportement de la Tpase
pleine longueur et d'un dérivé de délétion OrfAB C-ter, OrfAB[1-149].
Étant donné qu'environ 30 à 35 résidus aa restent masqués dans le
tunnel ribosomique de 100 Å (Maier et al., 2005), nous avons comparé la
liaison de trois dérivés d'OrfAB : OrfAB[1-149]+36 conservant 36 acides
aminés en aval ; OrfAB[1-149]+3HA avec une triple étiquette HA de 40
acides aminés (Fedorov et Baldwin, 1995) et l'OrfAB pleine longueur,
OrfAB[1-382]+3HA, portant également le triple tag HA. L'activité du
système de transcription/traduction couplé a été vérifiée pour
OrfAB[1-382]+3HA par analyse Western blot avec un anticorps anti-HAtag
(Figure S1). Production d'OrfAB[1-149]+3HA,
C
Figure 2. Analyse des différentescisoutransEST911Configurations de protéines
à l'aide de tests de croisement
(A) Les protéines IS911 ont été fournies à partir d'une configuration orf de type sauvage où
la transposase a été produite par décalage de cadre de traduction danstranss (i) ou danscis(
ii) par rapport au transposon.
(B) Expériences utilisant la transposase fusionnée OrfAB (WT) ou avec un motif de
décalage de cadre muté (mutant FS déstabilisant la structure tige-boucle) danstrans(i
et iii) ou danscis(ii et iv) par rapport au plasmide porteur du transposon. La grande
variation d'environ 20 % obtenue dans (ii) est due à la fréquence de transposition
exceptionnellement élevée et à la viabilité réduite des cellules donneuses qui
l'accompagne. (C) Effet de la distance de l'OrfAB par rapport à son IR cible. n =
nombre de paires de bases entre l'IRL etorfAB. La distance entre le début deorfABet
l'IRR est constant (environ 6150 pb) et toujours plus long que celui entreorfABet IRL.
Les valeurs sont la moyenne d'au moins trois expériences. Les parenthèses indiquent
l'écart type.
faciliter le repliement et la liaison du domaine N-terminal naissant. Pour
étudier l'effet de ce site de pause potentiel sur l'activité OrfAB, nous avons
utilisé un mutant avec une stabilité tige-boucle réduite mais dans lequel les
mutations introduisent des codons synonymes générant un OrfAB de type
sauvage (Figure 1B). Ce mutant (#350 dans (Rettberg et al., 1999)) présente
une réduction de 6,4 fois du décalage du cadre de lecture, ce qui reflète
probablement une réduction de la pause ribosomique. La transposition a été
mesurée in vivo à l'aidecisoutransconfigurations dans un essai
d'accouplement (Figure 2B). En utilisant untransconfiguration (où la Tpase est
exprimée à partir de plasmides distincts de ceux portant les extrémités),
aucune différence significative d'activité avec le type sauvage n'a été observée
(comparerChiffres 2Bi et 2Biii) montrant que le
OrfAB[1-149], OrfAB[1-382] et OrfAB[1-382]+3HA étaient également
démontré par35Marquage de la S-méthionine (visualisé par PAGE) (Figure
S1). Un fragment contenant l'IRR marqué à l'extrémité de 100 pb a été
ajouté 30 min après le début de la réaction (voirProcédures
expérimentales). L'incubation avec l'IR a été poursuivie pendant 30 min
avant de passer les échantillons à travers une colonne Biogel ACA34