Lakhasly

الإختبارات الفسیولوجیة لتعریف الخمائر
Physiological tests for yeasts identification
مازالت الخواص الفسیولوجیة ھامة في تعریف سلالات الخمیرة وفیما یلي نتناول
الإختبارات الفسیولوجیة لتعریف الخمائر:
یمكن ملاحظة الإستفادة من السكریات تحت الظروف غیر الھوائیة بصفة عامى عن
طریق تقدیر كمیة غاز ثاني أكسید الكربون المتكونة والتي یتم تجمیعھا في أنابیب
وقد ثار جدل بین العلماء حول أھمیة ھذة الإختبارات حیث اعتبر البعض أنھا
غیر دقیقة بالنسبة للخمائر المعروفة بأن لھا نشاط تخمیري بطیئ وذلك لأن كمیة ثاني
أكسید الكربون الناتجة بواسطة ھذة الخمائر لا تتكون بسرعة بسبب ذلك اعتبرت بعض
الخمائر أن لیس لھا نشاط تخمیري وظل ھذا الإعتقاد سائد بالنسبة لبعض أنواع الخمائر
ومع ذلك مازالت تتبع طریقة تجمیع غاز ثاني أكسید الكربون في أنابیب
دورھام في تعریف الخمائر وذلك بسبب سھولة القیام بھا.التخمري للخمیرة بإستخدام سكر الجلوكوز. فإذا لم یلاحظ حدوث تخمر لسكر الجلوكوز
فلا یكون ھناك حاجة لإجراء مزید من التخمر علي السكریات الأخري لأن الخمیرة التي
لا تستطیع أن تخمر سكر الجلوكوز لن تستطیع تخمر باقي السكریات.المستخدمة في تعریف الخمائر ھي (الجلوكوز، التریھالوز والزیلوز).یتم اختبار السكریات عند تركیز 2) %وزن/حجم) (أو4 %بالنسبة لسكر الرافینوز) في
البیئة الأساسیة التي یتحتوي علي 2) %وزن/حجم) مستخلص خمیرة و 5.وذلك في أنابیب اختبار تحتوي كل أنبوبة علي 3 إلي 5.أنبوبة صغیرة في وضع مقلوب لتتجمع بھا فقاعات غاز ثاني أكسید الكربون المتكونة.ً إلي البیئة المعقمة والمحتویة أیضا
یضاف السكر الذي تم تعقیمة منفصلا
البرومیثایمول blue Bromthymol وھو دلیل یبین التغیر في رقم ال pH .الأنابیب بلقاح مكثف من المزرعة المراد اختبارھا، ویجب أن یكون اللقاح من مزرعة
تحضن الأنبیب علي درجة حرارة من 25 إلي 28م
الأنواع المحبة للحرارة المنخفضة تحتاج إلي تحضین علي
o درجة حرارة 12 إلي 17م
Carbon assimilation test :الكربون تمثیل إختبار- 2
تمثیل مركبات الكربون یمكن أن یختبر بطریقة النمو في بیئة النمو في أنابیب تحتوي
علي بیئة سائلة وھي طریقة حساسة وتستعمل في التعریف. وفي ھذة الطریقة یتم اختبار
قدرة الخمائر علي النمو في بیئات تحتوي علي أي من السكریات الأتیة:
1 -الھكسوزات أوالسكریات السداسیة (الجلوكوز،2 -النتوزات أو السكریات الخماسیة (الزیلوز،5 -السكریات المتعددة (النشا الذائب،6 -الكحولات (الإریثیرتول Erythritol ،7 -الأحماض العضویة (السكسینیك،8 -الجلیكوسیدات (ألفا-میثیل-د-جلوكوسید glucoside-D-methyl-α ،تتلخص الخطوات العملیة لإختبار تمثیل الكربون فیما یلي:
- یضاف مصدر الكربون المراد اختبار قدرة الخمیرة علي تمثیلھ إلي بیئة نمو الخمیرة
5 %ماعدا سكر الرافینوز الذي یضاف بنسبة 1.- یتم ضبط رقم ال pH بعد ذلك لیكون 6.5 ذلك بالنسبة لمصادر الكربون التي یكون
مصدرھا غیر طبیعي مثل الأحماض العضویة.- تعبأ أنابیب اختبار بالماء المقطر بحیث تحتوي كل أنبوبة علي 5.0 مل من محلول السكرالمراد اختبار قدرة الخلایا علي تمثیلة.- تلقح الأنابیب بمعلق الخمائر المراد اختبارھا ثم یقاس النموعن طریق قیاس العكارة
o وذلك بعد التحضین علي درجة حرارة 25م
- سوف یكون النمو أسرع إذا تم رج الأنابیب لمدة نصف ساعة.الخمائرالمتوقع أنھا تحب الحرارة المنخفضة أو التي ثبت في أي اختبار احتمالي أنھا
o محبة للحرارة المنخفضة علي 12 إلي 17م
Nitrogen assimilation tests :النیتروجین تمثیل إختبارات- 3
تستخدم المركبات النیتروجینیة التي تشمل النترات، الإیثیل أمین Ethylamine ،ل-
والكادافرینن Cadaverine ،بشكل روتیني في تعریف الخمائر،وذلك علي نفس الأساس المتبع في اختبارات تمثیل الكربون.ومن ناحیة أخري،و and Kurtzman
l,Fel سنة 1998م خطوات بسیطة لمعرفة الوضع التقسیمي للخمیرة تعتمد علي قدرة
المیكروبات علي تمثیل 43 نوع من المواد العضویة كمصدر وحید للكربون ومقدرتھا
علي تمثیل 9 مواد نیتروجینیة كمصدر وحید للنیتروجین. فبالنسبة لإختبار النمو علي
0 %
خلیة/مل. ویقدر تمثیل ھذة المواد -5 بدون أحماض أمینیة بحیث یكون حجم اللقاح 10x2
ً مي الخمائر أن تن
أما بالنسبة لإختبار قدرتھا علي تمثیل المواد النیتروجینیة فیجب أولا
بغرض تجویعھا للنیتروجین. بعد ذلك تلقح الخمائر الجائعة للنیتروجین في أنابیب إختبار
1 %من بیئة YCB.29
للتعرف Diazonium Blue B (DBB) color test الدایزونیم إختبارأزرق یجري
علي الخمائر الأسكیة والخمائر البازیدیة.خلال تكون مركبات الأمیلوید Amyloid وھي عبارة عن سكریات مختلفة تتكون
0 %و 1.0 %
سیكلوھیكسامید Cycloheximide ،وحامض الخلیك كما یلاحظ الشكل المورفولوجي
للخلایا ولونھا وتكون الخیوط.تستخدم اختبارات حاجة الخمیرة إلي الفیتامینات في عملیة التعري. وتجري ھذة
من الفیتامینات فإذا حدث نمو تلقح أنبوبة ثانیة من الأولي للحكم علي مدي احتفاظ ھذة
السلالة بخاصیة عدم الحاجة إلي الفیتامینات،الفیتامینات المختلفة ویتم الحكم علي حاجة الخمائر إلي الفیتامینات من خلال ملاحظة
النمو بعد إضافة كل فیتامین.یوجد عدد أخر من الإختبارات الفسیولوجیة التي قد تسھل عملیة تعریف سلالات
الخمیرة. ھذة الإختبارات تشمل الأتي:
A
یجري ھذا الإختبار في بیئة خمیرة تحتوي علي نیتروجین حیث یضاف 5.محلول السیكلوھیكسامید 1.0 %أو 1 %والذي تم تعقیمة عن طریق الترشیح إلي 5.4 مل
من محلول الجلوكوز 5.السیكلوھیكسامید قیمتة 100 جزء في الملیون أو 100 جزء في الملیون علي التوالي.30
Growth on 50% glucose :جلوكوز% 50 في النمو.بیئة آجار- مستخلص الخمیرة المحتویة علي 50 %جلوكوز.أسبوع من التحضین.Production of Acetiv acid :الخلیك حامض إنتاج.بیئة آجار-جلوكوز-ببتون-مستتخلص الخمیرة والمضاف لھا 5.0) %وزن/حجم)
ویلاحظ إنتاج حامض الخلیك من خلال تكون منطقة رائقة حول
المزرعة النامیة بعد التحضین.في أنابیب (5.0مل) وتخزن الأنابیب في
أو علي درجة الحرارة o الفریزر. بعد التلقیح تحضن الأنابیب علي درجة حرارة 37م
یدل تغیر اللون إلي o القصوي بالنسبة للسلالات التي لھا درجة نمو قصوي أقل من 37م
E .تفاعل ملح ب دیازونیم الأزرق: reaction B blue Diazonium
یذاب قبل الإستعمال مباشرة ملح ب دیازونیم الأزرق 1.0) %وزن/حجم) في 1.حامض الھیدروكلوریك المثلج.مستخلص الخمیرة بالسلالة المراد اختبارھا وتحضن لمدة تتراوح بین عشرة أیام وثلاثة
أسابیع. تضاف قطرات من النلح المحضر طازجا ون ً علي المزرعة النامیة.المستعمرات السریع إلي الأحمر الداكن علي تفاعل موجب. F
Lugol بإذابة الیود (%33.0 (ویودید البوتاسیوم ,66. تضاف نقطة من المحلول إلي المزرعة النامیة في أنبوبة
یدل تكون اللون الأزرق الداكن علي وجود
عن مركبات النشا بعد أسبوع وبعد أسبوعین من التحضین.G .Candida
ھي وسیلة جدیدة انتقائیة، سریعة، وفعالة للتفرقة بین مزارع المبیضات Candida .تستخدم ھذه الوسیلة لعزل بعض أنواع المبیضات Candida المھمة سریرًیا وتحدیدھا
باستخدام Candida CHROMagar ،المبیضات على أساس لون المستعمرة. تتمثل المیزة الرئیسیة لـ CHROMagar
Candida في قدرتھا على اكتشاف المزارع المختلطة من المبیضات في العینات
الجلد،الحلق،البول،البراز،

الإختبارات الفسیولوجیة لتعریف الخمائر
Physiological tests for yeasts identification
مازالت الخواص الفسیولوجیة ھامة في تعریف سلالات الخمیرة وفیما یلي نتناول
الإختبارات الفسیولوجیة لتعریف الخمائر:
Fermentation tests :التخمر إختبارات- 1
یمكن ملاحظة الإستفادة من السكریات تحت الظروف غیر الھوائیة بصفة عامى عن
طریق تقدیر كمیة غاز ثاني أكسید الكربون المتكونة والتي یتم تجمیعھا في أنابیب
دورھام. وقد ثار جدل بین العلماء حول أھمیة ھذة الإختبارات حیث اعتبر البعض أنھا
غیر دقیقة بالنسبة للخمائر المعروفة بأن لھا نشاط تخمیري بطیئ وذلك لأن كمیة ثاني
أكسید الكربون الناتجة بواسطة ھذة الخمائر لا تتكون بسرعة بسبب ذلك اعتبرت بعض
الخمائر أن لیس لھا نشاط تخمیري وظل ھذا الإعتقاد سائد بالنسبة لبعض أنواع الخمائر
لمدة طویلة.ومع ذلك مازالت تتبع طریقة تجمیع غاز ثاني أكسید الكربون في أنابیب
ً اط اختبار النش
دورھام في تعریف الخمائر وذلك بسبب سھولة القیام بھا. یتم أولا
التخمري للخمیرة بإستخدام سكر الجلوكوز. فإذا لم یلاحظ حدوث تخمر لسكر الجلوكوز
فلا یكون ھناك حاجة لإجراء مزید من التخمر علي السكریات الأخري لأن الخمیرة التي
لا تستطیع أن تخمر سكر الجلوكوز لن تستطیع تخمر باقي السكریات. السكریات
المستخدمة في تعریف الخمائر ھي (الجلوكوز، الجلاكتوز، المالتوز، السكروز، الاكتوز،
الرافینوز، التریھالوز والزیلوز).
یتم اختبار السكریات عند تركیز 2) %وزن/حجم) (أو4 %بالنسبة لسكر الرافینوز) في
البیئة الأساسیة التي یتحتوي علي 2) %وزن/حجم) مستخلص خمیرة و 5.0 %ببتون
وذلك في أنابیب اختبار تحتوي كل أنبوبة علي 3 إلي 5.4 مل. في كل أنبوبة توضع
أنبوبة صغیرة في وضع مقلوب لتتجمع بھا فقاعات غاز ثاني أكسید الكربون المتكونة.
ً علي دلیل أزرق
ً إلي البیئة المعقمة والمحتویة أیضا
یضاف السكر الذي تم تعقیمة منفصلا
البرومیثایمول blue Bromthymol وھو دلیل یبین التغیر في رقم ال pH .تلقح
الأنابیب بلقاح مكثف من المزرعة المراد اختبارھا، ویجب أن یكون اللقاح من مزرعة
27
ویتم ملاحظتھا كل o حدیثة النمو. تحضن الأنبیب علي درجة حرارة من 25 إلي 28م
یومین لمدة أربعة أسابیع. الأنواع المحبة للحرارة المنخفضة تحتاج إلي تحضین علي
o درجة حرارة 12 إلي 17م
.
Carbon assimilation test :الكربون تمثیل إختبار- 2
تمثیل مركبات الكربون یمكن أن یختبر بطریقة النمو في بیئة النمو في أنابیب تحتوي
علي بیئة سائلة وھي طریقة حساسة وتستعمل في التعریف. وفي ھذة الطریقة یتم اختبار
قدرة الخمائر علي النمو في بیئات تحتوي علي أي من السكریات الأتیة:
1 -الھكسوزات أوالسكریات السداسیة (الجلوكوز، الجلاكتوز، الرامنوز والسوریوز).
2 -النتوزات أو السكریات الخماسیة (الزیلوز، الیبوز والأرابینوز).
3 -السكریات الثنائیة (السكروز، المالتوز، السلوبیوز، التریھالوز، الاكتوز والملوبیوز).
4 -السكریات الثلاثیة (الرافینوز، والملیزیتوز).
5 -السكریات المتعددة (النشا الذائب، والإنیولین).
6 -الكحولات (الإریثیرتول Erythritol ،الریبیتول Ribitol ،د-مانیتول-D
mannitol ،میثانول، إیثانول، جلیسرول، جلیكول، بروب ان2 ،1 دایول Propane
.(وسوربیتول، Butane 2,3 diol دایول 3،2 بیوتان، 1,2 diol
7 -الأحماض العضویة (السكسینیك، الستریك، الاكتیك، والجلوكونیك)
8 -الجلیكوسیدات (ألفا-میثیل-د-جلوكوسید glucoside-D-methyl-α ، أربیوتین
.( Saliciوسالیسین، arbutin
تتلخص الخطوات العملیة لإختبار تمثیل الكربون فیما یلي:

• یضاف مصدر الكربون المراد اختبار قدرة الخمیرة علي تمثیلھ إلي بیئة نمو الخمیرة
  بتركیز 0.5 %ماعدا سكر الرافینوز الذي یضاف بنسبة 1.%


• یتم ضبط رقم ال pH بعد ذلك لیكون 6.5 ذلك بالنسبة لمصادر الكربون التي یكون
  مصدرھا غیر طبیعي مثل الأحماض العضویة.


• تعبأ أنابیب اختبار بالماء المقطر بحیث تحتوي كل أنبوبة علي 5.4 مل وتعقم.
  28


• یضاف لكل أنبوبة 5.0 مل من محلول السكرالمراد اختبار قدرة الخلایا علي تمثیلة.


• تلقح الأنابیب بمعلق الخمائر المراد اختبارھا ثم یقاس النموعن طریق قیاس العكارة
  لمدة 7 ،14 ،21 ،أو 28 یوم. o وذلك بعد التحضین علي درجة حرارة 25م


• سوف یكون النمو أسرع إذا تم رج الأنابیب لمدة نصف ساعة. تحضن
  الخمائرالمتوقع أنھا تحب الحرارة المنخفضة أو التي ثبت في أي اختبار احتمالي أنھا
  o محبة للحرارة المنخفضة علي 12 إلي 17م
  .
  Nitrogen assimilation tests :النیتروجین تمثیل إختبارات- 3
  تستخدم المركبات النیتروجینیة التي تشمل النترات، الإیثیل أمین Ethylamine ،ل-
  لایسین Lysine-L ،والكادافرینن Cadaverine ،بشكل روتیني في تعریف الخمائر،
  وذلك علي نفس الأساس المتبع في اختبارات تمثیل الكربون. كما تستخدم مواد نیتروجینیة
  إضافیة في عملیة التعریف مثل النتریت، الكیریاتین Creatine ،
  الكریاتینینCreatinine ،و الإیمیدازول Imidazole.
  ومن ناحیة أخري، وضع كل من Barnett وأخرون سنة 1990 ،و and Kurtzman
  l,Fel سنة 1998م خطوات بسیطة لمعرفة الوضع التقسیمي للخمیرة تعتمد علي قدرة
  المیكروبات علي تمثیل 43 نوع من المواد العضویة كمصدر وحید للكربون ومقدرتھا
  علي تمثیل 9 مواد نیتروجینیة كمصدر وحید للنیتروجین. فبالنسبة لإختبار النمو علي
  المواد العضویة تلقح أنابیب الإختبار المحتویة علي 50 ملیمول مادة عذویة و 67.0 %
  بیئة (YNB (Base Nitrogen Yeast وھي بیئة الخمیرة المعتمدة علي النیتروجین
  خلیة/مل. ویقدر تمثیل ھذة المواد -5 بدون أحماض أمینیة بحیث یكون حجم اللقاح 10x2
  عن طریق ملاحظة النمو بالعین المجردة.
  ً مي الخمائر أن تن
  أما بالنسبة لإختبار قدرتھا علي تمثیل المواد النیتروجینیة فیجب أولا
  لمدة عشرة أیام علي بیئة (YCB (Base Carbon Yeast خالیة من النیتروجین
  بغرض تجویعھا للنیتروجین. بعد ذلك تلقح الخمائر الجائعة للنیتروجین في أنابیب إختبار
  تحتوي علي 5 ملیمول مواد نیتروجینیة بالإضافة إلي 17.1 %من بیئة YCB.
  29
  للتعرف Diazonium Blue B (DBB) color test الدایزونیم إختبارأزرق یجري
  علي الخمائر الأسكیة والخمائر البازیدیة. أما الخمائر الكبسولیة فیتم التعرف علیھا من
  خلال تكون مركبات الأمیلوید Amyloid وھي عبارة عن سكریات مختلفة تتكون
  خارج الخلیة. كما یتم فحص خواص أخري مثل الحساسیة لتركیز 01.0 %و 1.0 %
  سیكلوھیكسامید Cycloheximide ،وحامض الخلیك كما یلاحظ الشكل المورفولوجي
  للخلایا ولونھا وتكون الخیوط.
  4 -الحاجة إلي الفیتامینات: requirements Vitamin
  تستخدم اختبارات حاجة الخمیرة إلي الفیتامینات في عملیة التعري. وتجري ھذة
  الإختبارات عن طریق تنمیة الخمائر في أنابیب تحتوي كل منھا علي 5 مل من بیئة خالیة
  من الفیتامینات فإذا حدث نمو تلقح أنبوبة ثانیة من الأولي للحكم علي مدي احتفاظ ھذة
  السلالة بخاصیة عدم الحاجة إلي الفیتامینات، وإذا لم یحدث نمو تبدأ اختبارات إضافة
  الفیتامینات المختلفة ویتم الحكم علي حاجة الخمائر إلي الفیتامینات من خلال ملاحظة
  النمو بعد إضافة كل فیتامین.
  Other physiological tests :أخري فسیولوجیة إختبارات- 5
  یوجد عدد أخر من الإختبارات الفسیولوجیة التي قد تسھل عملیة تعریف سلالات
  الخمیرة. ھذة الإختبارات تشمل الأتي:
  Resistance to Cycloheximide :السیكلوھیكسامید مقاومة. A
  یجري ھذا الإختبار في بیئة خمیرة تحتوي علي نیتروجین حیث یضاف 5.0 مل من
  محلول السیكلوھیكسامید 1.0 %أو 1 %والذي تم تعقیمة عن طریق الترشیح إلي 5.4 مل
  من محلول الجلوكوز 5.0) %وزن/حجم) في ماء مقطر لیعطي تركیز نھائي من
  السیكلوھیكسامید قیمتة 100 جزء في الملیون أو 100 جزء في الملیون علي التوالي.
  یلاحظ النمو بعد التلقیح بالسلالة المراد اختبارھا.
  30
  Growth on 50% glucose :جلوكوز% 50 في النمو. B
  یتم تلقیح السلالة المراد اختبارھا عن طریق التخطیط علي أنابیب أو أطباق تحتوي علي
  بیئة آجار- مستخلص الخمیرة المحتویة علي 50 %جلوكوز. ویسجل النمو بعد 1-2
  أسبوع من التحضین.
  Production of Acetiv acid :الخلیك حامض إنتاج. C
  یتم تلقیح السلالة المراد اختبارھا عن طریق التخطیط علي أنابیب أو أطباق تحتوي علي
  بیئة آجار-جلوكوز-ببتون-مستتخلص الخمیرة والمضاف لھا 5.0) %وزن/حجم)
  كربونات كالسیوم. ویلاحظ إنتاج حامض الخلیك من خلال تكون منطقة رائقة حول
  المزرعة النامیة بعد التحضین.
  D .نشاط إنزیم الیورییز: activity Urease
  توزع بیئة من مرق الیوریا broth R Urea ،في أنابیب (5.0مل) وتخزن الأنابیب في
  أو علي درجة الحرارة o الفریزر. بعد التلقیح تحضن الأنابیب علي درجة حرارة 37م
  . یدل تغیر اللون إلي o القصوي بالنسبة للسلالات التي لھا درجة نمو قصوي أقل من 37م
  أحمر غامق بعد 4 إلي 20 ساعة من التحضین علي نشاط إنزیم الیورییز.
  E .تفاعل ملح ب دیازونیم الأزرق: reaction B blue Diazonium
  یجري ھذا الإختبار للتفرقة بین الخمائر الأسكیة والخمائر البازیدیة، حیث أن الخمائر
  البازیدیة تظھر لون ھذا التفاعل.
  یذاب قبل الإستعمال مباشرة ملح ب دیازونیم الأزرق 1.0) %وزن/حجم) في 1.0 مول
  حامض الھیدروكلوریك المثلج. تلقح أطباق بتري المحتویة علي بیئة آجار-مولت-
  مستخلص الخمیرة بالسلالة المراد اختبارھا وتحضن لمدة تتراوح بین عشرة أیام وثلاثة
  أسابیع. تضاف قطرات من النلح المحضر طازجا ون ً علي المزرعة النامیة. یدل تحول ل
  المستعمرات السریع إلي الأحمر الداكن علي تفاعل موجب.
  31
  Extracellular starch production :الخارجي النشا أنتاج. F
  Lugol بإذابة الیود (%33.0 (ویودید البوتاسیوم , یحضر محلول لوجل solution s
  (66.0 (%في ماء مقطر. تضاف نقطة من المحلول إلي المزرعة النامیة في أنبوبة
  اختبار التمثیل والمحتویة علي د-جلوكوز. یدل تكون اللون الأزرق الداكن علي وجود
  مركبات تشبة النشا الخارجي. ویستحسن عمل مكررات من ھذا الإختبار. ثم یتم الكشف
  عن مركبات النشا بعد أسبوع وبعد أسبوعین من التحضین.
  G .إختباربیئة الكرومو أجار كاندیدا: test medium CHROMagar
  Candida
  ھي وسیلة جدیدة انتقائیة، سریعة، وفعالة للتفرقة بین مزارع المبیضات Candida .
  تستخدم ھذه الوسیلة لعزل بعض أنواع المبیضات Candida المھمة سریرًیا وتحدیدھا
  وتمیزھا. باستخدام Candida CHROMagar ، یمكن إجراء speciation من
  المبیضات على أساس لون المستعمرة. تتمثل المیزة الرئیسیة لـ CHROMagar
  Candida في قدرتھا على اكتشاف المزارع المختلطة من المبیضات في العینات
  السریریة.
  تحتوي ھذه الوسائط على ركائز chromogenic تتفاعل مع إنزیمات تفرزھا المبیضات
  Candida .ھذه الإنزیمات خاصة بالأنواع ، مما یسمح بتحدید المبیضات على مستوى
  الأنواع من خلال تطورھا اللوني وخصائصھا الاستعماریة. یمكن استخدام
  Candida CHROMagar مع العینات التالیة:(الدم،الجلد،البلغم،الحلق،البول،الأذنین
  ،البراز،والمھبل).العینات ذات الصلة یمكن معالجتھا عن طریق streaking مباشرة على
  الطبق.
  یتم تلقیح السلالات المراد اختبارھا عن طریق التخطیط علي أنابیب أو أطباق تحتوي
  علي بیئة Candida CHROMagar بعد التلقیح تحضن الأنابیب أو الأطباق في
  لمدة 20-48 ساعة. وبعد ذلك نفحص o الظروف الھوائیة عند درجة حرارة من 35 -37م
  لون المزارع.