Lakhasly

يتم التحفيز العكسي للدهون الثلاثية إلى حمض دهني بواسطة إنزيم الليباز. تعمل بعض الليباز على كل من تفاعلات الأسترة والتحلل المائي الانتقائي التماثلي. زاد الاهتمام بدراسة إنتاج الليباز على مدى السنوات القليلة الماضية بسبب خصائصها التحفيزية الممتازة، وإنتاج وقود الديزل الحيوي. يظهر إنزيم الليباز على نطاق واسع في البكتيريا والخمائر والفطريات. يزداد الطلب على إنتاج الليباز الميكروبي عالميًا بناءً على نوع المصدر. تحقق إيرادات كبيرة حيث من المتوقع أن تتجاوز 797. 7 مليون دولار أمريكي بحلول عام 20255. هناك نمو سريع في سوق الليباز حيث من المحتمل أن يمثل القطاع السائل أعلى معدل نمو من حيث الإيرادات في سوق الليباز. من المتوقع أن يسجل قطاع المسحوق معدل نمو سنوي مركب (CAGR) بنسبة 5. من المقترح أنه بحلول عام 2024، قد تشهد تطبيقات المنظفات مكاسب كبيرة وتتجاوز قيمتها 2 مليار دولار أمريكي. كان أكبر سوق للإنزيمات الصناعية هو سوق الأغذية والمشروبات بقيمة تقديرية بلغت 1. 4 مليار دولار أمريكي في عام 2017؛ يليه الوقود الحيوي والمنظفات بقيمة تقدر بـ 969. من المتوقع أن تكون الإنزيمات الصناعية في الوقود الحيوي هي القطاع الأسرع نموًا بمعدل نمو سنوي مركب يبلغ 7. 3% حتى عام 2024 في دبلن8. تتزايد أهمية الإنزيمات باستمرار، وخاصة الليباز الميكروبي الذي يحمل قيمة صناعية كبيرة نظرًا لقدرته على تحفيز مجموعة متنوعة من التفاعلات الكيميائية في البيئات المائية وغير المائية. من المتوقع أن يتجاوز سوق الليباز الدولي 797. ليرتفع بمعدل نمو سنوي مركب قدره 6. 2٪ من عام 2017 إلى عام 2025. تتوفر الإنزيمات من الحيوانات والنباتات والكائنات الحية الدقيقة تجاريًا، حيث يمثل الأصل الميكروبي المصدر الرئيسي لأكثر من 50% من الإنزيمات الصناعية. تم دمج ثلث إجمالي الإنزيمات الصناعية في جميع أنحاء العالم في المنظفات10. مع كون الاستقرار الحراري متطلبًا أساسيًا للإنزيمات التجارية، يجب ألا تؤثر درجات الحرارة المختلفة على التفاعل الأنزيمي للليباز. في حين أن الليباز يتحلل الدهون عند درجات حرارة منخفضة، فإن درجات الحرارة المرتفعة تزيد من معدلات تحلل الدهون في وجود الليباز. وكانت التطبيقات الصناعية الرئيسية لإنزيم الليباز هي صناعة المنظفات نظرًا لقدرته الرائعة على إزالة بقع الزيت من الأقمشة. يجب أن يكون مستقرًا حراريًا، ويمكن أن يؤدي إلى تحلل الهياكل الدهنية المختلفة. يعد استخدام الإنزيمات بدلاً من المنظفات الكيميائية التقليدية أكثر فعالية؛ لأنه يوفر الطاقة من خلال العمل في درجات حرارة منخفضة، وليس له أي تأثير سلبي على عمليات معالجة مياه الصرف الصحي. أفاد سايسوبرامانيان وآخرون 13 أن استخدام الليباز A. niger كمادة مضافة في منظفات الغسيل أظهر عدم استقرار متزايد في وجود SDS وTween 80 وجميع المنظفات التجارية. كانت الظروف المثلى في دراسة سايسوبرامانيان هي 1% للمنظفات التجارية، 5، ودرجة حرارة الغسيل عند 25 درجة مئوية. تمت إزالة 33% من بقع زيت الزيتون الموجودة في نسيج القطن. تم استخدام جنس Aspergillus من قبل في صناعة المنظفات، حيث أظهر الليباز المنقى من A. تبلغ درجة الحرارة المثلى لليباز A. carneus 37 درجة مئوية ودرجة الحموضة 9. وتشير الدراسة إلى أن وجود العديد من المنظفات يحفز نشاطه. أظهر الليباز الحراري والقلوي الذي تنتجه Talaromyces thermophilus مقاومة كبيرة للأس الهيدروجيني القلوي والتقطع والتحمل العالي مع العديد من المواد الخافضة للتوتر السطحي والأكسدة ومواد الغسيل التجارية. يمكن اعتبار هذا الإنزيم مرشحًا واعدًا ومرضيًا للتطبيق الصناعي لعملية التنظيف. يتم إجراء الغسيل بشكل عام في الوسائط القلوية، تشمل التطبيقات الأخرى للمنظفات غسل الأطباق، وتحلل الدهون في مذيبات التنظيف الجاف، استخدام الليباز مع الأكسدة في الغسيل وإزالة الشحوم وتجديد المياه يسمح بكميات أقل من المواد الخافضة للتوتر السطحي وتعمل في درجات حرارة منخفضة. عندما يتم دمج الليباز في المنظفات، فإنه يعزز التنظيف بشكل أفضل ويمنع تكون القشور. أظهر الليباز المستخرج من Rhizopus nigricans نشاطًا تحليليًا زائدًا للدهون ونشاط استحلاب طبيعي، مما يشير إلى أعلى معدل لإنتاج المواد الخافضة للتوتر السطحي. الهدف من هذه الدراسة هو (أ) تحديد الخصائص البيوكيميائية لنشاط الليباز واستقراره لـ A. 1؛ (ب) لاختبار نشاط الليباز للتطبيقات الصناعية مثل (ط) دمج الإنزيم مع المنظفات المسحوقة والسائلة (ب) تقييم قدرته على إزالة الدهون و (ب) إزالة بقع الزيت المختلفة من القماش. المواد والأساليب : 1 وMH079049. المملكة العربية السعودية. تم الحفاظ على الثقافات النقية لهذين الفطرين على مائل أجار دكستروز البطاطس وتخزينها عند درجة حرارة 4 درجات مئوية. niger MH079049. 1) باستخدام مرق Tween 80، باختصار، تم استخدام مخروطية فطرية (3 × 107 أبواغ/مل) معلقة في محلول ملح معدني لتطعيم السلالتين الفطريتين بشكل منفصل. بعد ذلك، بعد 5 أيام من الحضانة، تم استخدام ورق ترشيح Whatman رقم 1 لتصفية النمو الفطري لكل سلالة. بعد الطرد المركزي، تم الحصول على طافين واضحين يحتويان على إنزيم الليباز الخام لكل سلالة. فحص إنتاج الليباز باستخدام p-Nitrophenyl Palmitate (pNPP) كركيزة نظرًا لأن الليباز يكسر الركيزة p-Nitrophenyl Palmitate (pNPP)، فقد تم استخدام طريقة التحلل المائي pNPP الشائعة لتقييم إنتاج الليباز. لكل سلالة، تمت إضافة قسامة (100 ميكرولتر) من كل طاف واضح إلى 900 ميكرولتر من خليط التفاعل بالتركيبة التالية: 800 ميكرولتر من محلول كحول البولي فينيل 0. 25٪ عند درجة حموضة 6. 5 و100 ميكرولتر من محلول pNPP (3 مم) في الأيزوبروبانول. بعد الحضانة، تم إنهاء التفاعل بإضافة 500 ميكرولتر من حمض الهيدروكلوريك (3 مم) إلى المخاليط (1:1 حجم / حجم). تمت إضافة قسامة (500 ميكرولتر) من الخليطين الأخيرين إلى 1 مل من NaOH (2 مم). لقياس نشاط الإنزيم، تم استخدام منحنى قياسي كما هو موضح سابقًا بواسطة أوليفيرا وآخرون. في ظل الظروف المحددة. مميزة للليباز في الرقم الهيدروجيني 8، تم اتباع الإجراء Sethi et al. 26 لتحديد درجة الحرارة الفعالة لنشاط إنزيم الليباز واستقراره. تم استخدام المواد الطافية الواضحة مع هذه العوامل لتحديد الظروف المثلى لنشاط الليباز واستقراره لاستخدامه في مختلف التطبيقات الصناعية والتجارية: (أ) درجات حرارة مختلفة تتراوح من 25 إلى 70 درجة مئوية؛ (ب) درجة حموضة مختلفة تتراوح من 1 إلى 10 لمدة 24 ساعة؛ الأسيتون)28؛ توين 20، EDTA)27. تحديد كفاءة الليباز بعد تحديد الحالة المثلى للإنزيم، تم اختبار المواد الطافية الواضحة، لكفاءتها في المنظفات (A)؛ (ب) إزالة بقع الزيت من الأقمشة؛ (ج) الدهون الحيوانية الطبيعية المهينة pandah، 30. باختصار، تم خلط المواد الطافية الصافية مع المنظفات السائلة و/أو المسحوقة بتركيزات 0. 1% و1% (حجم:حجم أو وزن/حجم) لمدة 30 دقيقة عند 35 درجة مئوية. تم أيضًا اختبار المواد الطافية الواضحة لكفاءتها في إزالة بقع الزيت من الأقمشة وفقًا لبروتوكول Das et al. 31. باختصار، تم تقطيع قماش بولي قطن إلى قطع (3 سم ×   2 سم) وتم تلطيخ كل قطعة بقطرة من زيت السيارة أو السمك المقلي أو زيت الشوكولاتة. تم بعد ذلك ترك قطع القماش حتى تجف ووضعها في دورق سعة 100 مل مع أربع معالجات مختلفة. كانت المعالجات الأربعة هي: (أ) ماء (100 مل)، (ب) ماء مع منظف 1% (وزن/حجم) (99 مل  + 1 مل)، (ج) ماء مع الليباز (99 مل  + 1 مل)، ( د) ماء مع الليباز ومنظف (98 مل  + 1 مل  + 1 مل). تم إجراء كل علاج على نسختين، مرة واحدة بالماء البارد (25   ±   2 درجة مئوية) ومرة ​​بالماء الساخن (65   ±   2 درجة مئوية). تم تحضين جميع العلاجات وتحريكها بلطف لمدة 30 دقيقة. لتقدير كمية الأحماض الدهنية الحرة التي تم إطلاقها خلال كل علاج، 32. تحلل الدهون الحيوانية الطبيعية : تم اختبار المواد الطافية الواضحة لكفاءتها في تحطيم الدهون الحيوانية الطبيعية بعد بروتوكول Uppada et al. 5 جم) ووضعها في أنابيب قبل إضافة المواد الطافية الصافية. niger MH078571. 1 وA. بعد الحضانة، تم وزن قطع الدهون، 25. تحليل احصائي : تم إجراء جميع التجارب في ثلاث نسخ (ن  =  3) واستخدمت القيم المتوسطة. تمثل العلامة ±   وأشرطة الخطأ الانحراف المعياري للمتوسط. 0. تم فحص الفروق الأقل أهمية (LSD) من خلال تحليل التباين (ANOVA) باستخدام برنامج SPSS الإصدار 2334. الموافقة الأخلاقية : نتائج : المواد الخافضة للتوتر السطحي، لذلك، تمت زراعة كلا العزلتين A. niger MH078571. 1 و A. 1 تحت الظروف المثالية التالية للحصول على أعلى نشاط لليباز الفطري الخام: تأثير درجة الحرارة : وبشكل عام فإن ارتفاع درجة الحرارة يؤدي إلى تسارع التفاعلات الكيميائية. ومع ذلك، يجب الأخذ في الاعتبار أن الإنزيمات عبارة عن بروتينات ويمكن أن تتلف بسبب الحرارة المرتفعة جدًا أو عند تعرضها للحرارة لفترة طويلة. يتمتع كل إنزيم بنطاق درجة حرارة مثالي حيث يؤدي أفضل أداء؛ كان أعلى نشاط لإنتاج الليباز بواسطة A. 1 عند 45 درجة مئوية، حيث تم الحصول على أعلى أداء لليباز بعد ساعة من الحضانة (794. 23 وحدة / مل) (الجدول التكميلي S1). بعد 24 ساعة من الحضانة، فقد تأثير نشاط الليباز عند 45 درجة مئوية 16٪ فقط (الشكل التكميلي S1). ومع ذلك، بالنسبة لـ A. niger MH079049. حيث تم الحصول على أعلى أداء لليباز بعد ساعة من الحضانة (796. كان نشاط الليباز لـ A. niger MH079049. 39 و795. 77 وحدة/مل، على التوالي. (الجدول التكميلي S2). بعد 24 ساعة من الحضانة، فقدت سلالة A. niger MH078571. 1 14٪ من نشاط الليباز عند درجة الحموضة 8 بينما فقدت سلالة A. تعتبر فعالية الإنزيم في وجود هذه المذيبات ضرورية وضرورية في العمليات الصناعية. يليه الميثانول والبيوتانول بينما كان الأيزوبروبانول والإيثانول الأقل تنشيطاً للإنزيم. تم استخدام المذيبات العضوية بتركيزين مختلفين (50% و100%) لاختبار النشاط الأمثل للليباز لكلا العزلتين. ومن المذيبات العضوية بلغت فعالية نشاط الليباز 96. 5% للفطر A. niger MH078571. niger MH079049. تأثير المواد الخافضة للتوتر السطحي : كان نشاط الليباز لكلتا العزلتين أفضل عند التركيز 0. 42% لـ A. niger MH078571. 1 و 112. 4% لـ A. 1%. كان نشاط الليباز في وجود SDS هو الأقل فعالية بتركيز 0. 1٪ (الجدول التكميلي S4؛ ترتبط الأيونات بالإنزيمات وتنشطها. الأيونات المرتبطة بالإنزيم يمكن أن تحسن أو تمنع نشاط الإنزيم. 1% و 1%) لاختبار النشاط الأمثل للليباز لكلتا العزلتين. أظهر تركيز الأيونات 0. ومن بين الأيونات الثمانية بلغت فعالية نشاط الليباز 102% لعزلة A. niger MH078571. 1 بوجود كل من كبريتات المنغنيز وكبريتات الزنك. بالنسبة لـ A. niger MH079049. الشكل التكميلي S5). تحديد درجة حرارة التخزين المثلى للليباز : تم توضيح العلاقة بين نشاط الليباز ودرجة حرارة التخزين في الجدول التكميلي S6 والأشكال التكميلية S6. أفضل درجة حرارة تخزين لـ A. 1 كانت عند – 80 درجة مئوية، niger MH. 079049. 1، حافظ الإنزيم على أكثر من 73. 04% من نشاطه عند -80 درجة مئوية بعد 4 أسابيع. لقد فقد هذا الإنزيم حوالي 98٪ من فعاليته في نفس ظروف التخزين عند 25 درجة مئوية بعد أربعة أسابيع (الجدول التكميلي S6). تحديد كفاءة نشاط الليباز في مخلفات الزيوت الطبيعية : يعد الزيت أحد العوامل الأساسية والأكثر أهمية في تحفيز إنتاج الإنزيم. ولذلك، تم استخدام أنواع مختلفة من بقايا النفط الموجودة في الطبيعة لكل من العزلتين A. 1 (الجدول التكميلي S7). إلا أن النتائج أظهرت أن الزيت المركب حافظ على نشاطه العالي خلال 15 يوما. تم استخدام العديد من المنظفات المسحوقة والسائلة بتركيزين مختلفين 0. niger MH078571. 07% لـ A. 1 مع 1% Omo و95. 08% لـ A. niger MH. 079049. 1 مع 1% Persial (الجدول التكميلي S8). niger MH078571. 1 مع 0. 1٪ Fairy و 97. 54٪ لـ A. niger MH. الأشكال التكميلية S7) -S8). إزالة بقع الزيت : لتحديد مدى فعالية الليباز في إزالة بقع الزيت من الأقمشة القطنية، تمت مقارنة أربع علاجات (الجدول 1 والشكل التكميلي S9). الشكل التكميلي S10). ). في المقابل، عند درجة حرارة 65 درجة مئوية عند معالجة القماش القطني بمنظف وحده، تمت إزالة حوالي 45% فقط من بقع الزيت؛ وعند معالجتها بالإنزيم وحده، تمت إزالة ما يقرب من 50% من بقع الزيت. من بين أنواع الزيوت الثلاثة (زيت السيارة، زيت السمك، وزيت الشوكولاتة)، كان لزيت السمك أعلى نشاط إنزيمي لكلتا العزلتين في وجود المنظفات والإنزيم معًا عند درجة حرارة 65 درجة مئوية. يمكن لإنزيم الليباز تحلل الدهون الثلاثية إلى أحماض دهنية وجلسرين. تم اعتماد قدرة الإنزيم هذه على تحليل الدهون الحيوانية (الدجاج والأغنام). S12). كان نشاط الليباز مرتفعًا في الأيام الثلاثة الأولى، حيث تمت أكثر من نصف عملية التحلل. مناقشة : الليباز هو أحد المحفزات الحيوية الأساسية. أنه يحفز التحلل المائي للدهون الثلاثية إلى الجلسرين والأحماض الدهنية.

مقدمة :
يتم التحفيز العكسي للدهون الثلاثية إلى حمض دهني بواسطة إنزيم الليباز. تعمل بعض الليباز على كل من تفاعلات الأسترة والتحلل المائي الانتقائي التماثلي. زاد الاهتمام بدراسة إنتاج الليباز على مدى السنوات القليلة الماضية بسبب خصائصها التحفيزية الممتازة، والتطبيقات الصناعية المتنوعة، بما في ذلك المنظفات، والأسترة، والمستحضرات الصيدلانية، وإنتاج وقود الديزل الحيوي. يظهر إنزيم الليباز على نطاق واسع في البكتيريا والخمائر والفطريات. يزداد الطلب على إنتاج الليباز الميكروبي عالميًا بناءً على نوع المصدر. تحقق إيرادات كبيرة حيث من المتوقع أن تتجاوز 797.7 مليون دولار أمريكي بحلول عام 20255. هناك نمو سريع في سوق الليباز حيث من المحتمل أن يمثل القطاع السائل أعلى معدل نمو من حيث الإيرادات في سوق الليباز. علاوة على ذلك، من المتوقع أن يسجل قطاع المسحوق معدل نمو سنوي مركب (CAGR) بنسبة 5.4% حتى عام 20266. من المقترح أنه بحلول عام 2024، قد تشهد تطبيقات المنظفات مكاسب كبيرة وتتجاوز قيمتها 2 مليار دولار أمريكي. وفي عام 2017، كان أكبر سوق للإنزيمات الصناعية هو سوق الأغذية والمشروبات بقيمة تقديرية بلغت 1.4 مليار دولار أمريكي في عام 2017؛ يليه الوقود الحيوي والمنظفات بقيمة تقدر بـ 969.3 مليون دولار أمريكي و754.4 مليون دولار أمريكي على التوالي. من المتوقع أن تكون الإنزيمات الصناعية في الوقود الحيوي هي القطاع الأسرع نموًا بمعدل نمو سنوي مركب يبلغ 7.3% حتى عام 2024 في دبلن8. تتزايد أهمية الإنزيمات باستمرار، وخاصة الليباز الميكروبي الذي يحمل قيمة صناعية كبيرة نظرًا لقدرته على تحفيز مجموعة متنوعة من التفاعلات الكيميائية في البيئات المائية وغير المائية. من المتوقع أن يتجاوز سوق الليباز الدولي 797.7 مليون دولار أمريكي حتى عام 2025، ليرتفع بمعدل نمو سنوي مركب قدره 6.2٪ من عام 2017 إلى عام 2025. تتوفر الإنزيمات من الحيوانات والنباتات والكائنات الحية الدقيقة تجاريًا، حيث يمثل الأصل الميكروبي المصدر الرئيسي لأكثر من 50% من الإنزيمات الصناعية. تم دمج ثلث إجمالي الإنزيمات الصناعية في جميع أنحاء العالم في المنظفات10. مع كون الاستقرار الحراري متطلبًا أساسيًا للإنزيمات التجارية، يجب ألا تؤثر درجات الحرارة المختلفة على التفاعل الأنزيمي للليباز. في حين أن الليباز يتحلل الدهون عند درجات حرارة منخفضة، فإن درجات الحرارة المرتفعة تزيد من معدلات تحلل الدهون في وجود الليباز.
وكانت التطبيقات الصناعية الرئيسية لإنزيم الليباز هي صناعة المنظفات نظرًا لقدرته الرائعة على إزالة بقع الزيت من الأقمشة. ومع ذلك، من أجل استخدام الليباز، يجب أن يكون مستقرًا حراريًا، ومتحملًا للقلوية، ويمكن أن يؤدي إلى تحلل الهياكل الدهنية المختلفة. يعد استخدام الإنزيمات بدلاً من المنظفات الكيميائية التقليدية أكثر فعالية؛ لأنه يوفر الطاقة من خلال العمل في درجات حرارة منخفضة، وهو صديق للبيئة، وليس له أي تهديد للحياة المائية، وليس له أي تأثير سلبي على عمليات معالجة مياه الصرف الصحي. أفاد سايسوبرامانيان وآخرون 13 أن استخدام الليباز A. niger كمادة مضافة في منظفات الغسيل أظهر عدم استقرار متزايد في وجود SDS وTween 80 وجميع المنظفات التجارية. كانت الظروف المثلى في دراسة سايسوبرامانيان هي 1% للمنظفات التجارية، و75 وحدة من الليباز، ودرجة الحموضة 9.5، ودرجة حرارة الغسيل عند 25 درجة مئوية. وفي ظل هذه الظروف، تمت إزالة 33% من بقع زيت الزيتون الموجودة في نسيج القطن. تم استخدام جنس Aspergillus من قبل في صناعة المنظفات، حيث أظهر الليباز المنقى من A. carneus نتائج واعدة. تبلغ درجة الحرارة المثلى لليباز A. carneus 37 درجة مئوية ودرجة الحموضة 9. وتشير الدراسة إلى أن وجود العديد من المنظفات يحفز نشاطه. أظهر الليباز الحراري والقلوي الذي تنتجه Talaromyces thermophilus مقاومة كبيرة للأس الهيدروجيني القلوي والتقطع والتحمل العالي مع العديد من المواد الخافضة للتوتر السطحي والأكسدة ومواد الغسيل التجارية. وبالتالي، يمكن اعتبار هذا الإنزيم مرشحًا واعدًا ومرضيًا للتطبيق الصناعي لعملية التنظيف. يتم إجراء الغسيل بشكل عام في الوسائط القلوية، ويفضل الليباز هذه الحالة، مثل الليباز المشتق من A. oryzae16. تشمل التطبيقات الأخرى للمنظفات غسل الأطباق، وفي تركيبات التبييض، وتحلل الدهون في مذيبات التنظيف الجاف، ومنظف الجلد السائل، وتنظيف العدسات اللاصقة. استخدام الليباز مع الأكسدة في الغسيل وإزالة الشحوم وتجديد المياه يسمح بكميات أقل من المواد الخافضة للتوتر السطحي وتعمل في درجات حرارة منخفضة. عندما يتم دمج الليباز في المنظفات، فإنه يعزز التنظيف بشكل أفضل ويمنع تكون القشور. في الآونة الأخيرة، أظهر الليباز المستخرج من Rhizopus nigricans نشاطًا تحليليًا زائدًا للدهون ونشاط استحلاب طبيعي، مما يشير إلى أعلى معدل لإنتاج المواد الخافضة للتوتر السطحي. الهدف من هذه الدراسة هو (أ) تحديد الخصائص البيوكيميائية لنشاط الليباز واستقراره لـ A. niger MH078571.1 وA. niger MH079049.1؛ (ب) لاختبار نشاط الليباز للتطبيقات الصناعية مثل (ط) دمج الإنزيم مع المنظفات المسحوقة والسائلة (ب) تقييم قدرته على إزالة الدهون و (ب) إزالة بقع الزيت المختلفة من القماش.

المواد والأساليب :
مصدر عزلات السلالات الفطرية تم الحصول على أعلى سلالتين منتجتين للليباز تم تحديدهما بواسطة تسلسل الحمض النووي الريبوزي 18S الجزئي باسم Aspergillus niger (GenBank Accession No. MH078571.1 وMH079049.1) من دراسة سابقة23 في معهد البحوث والاستشارات الطبية (IRMC) في الإمام عبد الرحمن بن فيصل الجامعة، الدمام، المملكة العربية السعودية. تم الحفاظ على الثقافات النقية لهذين الفطرين على مائل أجار دكستروز البطاطس وتخزينها عند درجة حرارة 4 درجات مئوية. إنتاج الليباز عن طريق التخمر المغمور تم عزل الليباز الذي تنتجه كلتا السلالتين (A. niger MH078571.1 وA. niger MH079049.1) باستخدام مرق Tween 80، باتباع البروتوكول الموجود في Ayinla et al.24. باختصار، تم استخدام مخروطية فطرية (3 × 107 أبواغ/مل) معلقة في محلول ملح معدني لتطعيم السلالتين الفطريتين بشكل منفصل. تم تلقيح قسامة (2 مل) من كل من هذه المعلقات في وسط محلول الملح المعدني المعقم. بعد ذلك، تم تحضين كلا الوسطين المعقمين لمدة 5 أيام عند درجة حرارة 25   ±   2 درجة مئوية على شاكر دوار عند 200 دورة في الدقيقة. بعد 5 أيام من الحضانة، تم استخدام ورق ترشيح Whatman رقم 1 لتصفية النمو الفطري لكل سلالة. تم طرد أوراق ترشيح Whatman التي تحتوي على الثقافات الفطرية المصفاة عند 1200 دورة في الدقيقة لمدة 30 دقيقة عند 4 درجات مئوية. بعد الطرد المركزي، تم الحصول على طافين واضحين يحتويان على إنزيم الليباز الخام لكل سلالة. فحص إنتاج الليباز باستخدام p-Nitrophenyl Palmitate (pNPP) كركيزة نظرًا لأن الليباز يكسر الركيزة p-Nitrophenyl Palmitate (pNPP)، فقد تم استخدام طريقة التحلل المائي pNPP الشائعة لتقييم إنتاج الليباز. باتباع إجراء Oliveira et al.25، لكل سلالة، تمت إضافة قسامة (100 ميكرولتر) من كل طاف واضح إلى 900 ميكرولتر من خليط التفاعل بالتركيبة التالية: 800 ميكرولتر من محلول كحول البولي فينيل 0.25٪ عند درجة حموضة 6.5 و100 ميكرولتر من محلول pNPP (3 مم) في الأيزوبروبانول. تم تحضين مخاليط التفاعل لمدة 15 دقيقة عند 30 درجة مئوية. بعد الحضانة، تم إنهاء التفاعل بإضافة 500 ميكرولتر من حمض الهيدروكلوريك (3 مم) إلى المخاليط (1:1 حجم / حجم). تمت إضافة قسامة (500 ميكرولتر) من الخليطين الأخيرين إلى 1 مل من NaOH (2 مم). تم استخدام مقياس الطيف الضوئي (Spectro UV–Vis Double) لقياس إنتاج الليباز عند 410 نانومتر. لقياس نشاط الإنزيم، تم استخدام منحنى قياسي كما هو موضح سابقًا بواسطة أوليفيرا وآخرون. تم تعريف وحدة واحدة من نشاط الليباز على أنها كمية الليباز المطلوبة لإطلاق 1 ميكرومتر من pNPP في دقيقة واحدة، في ظل الظروف المحددة. مميزة للليباز في الرقم الهيدروجيني 8، تم تحديد درجة الحرارة المثلى وفقًا لدراستنا السابقة على أنها 45 و55 لـ A. niger MH078571.1 وA. niger MH079049.1، على التوالي. تم اتباع الإجراء Sethi et al.26 لتحديد درجة الحرارة الفعالة لنشاط إنزيم الليباز واستقراره.
تم استخدام المواد الطافية الواضحة مع هذه العوامل لتحديد الظروف المثلى لنشاط الليباز واستقراره لاستخدامه في مختلف التطبيقات الصناعية والتجارية: (أ) درجات حرارة مختلفة تتراوح من 25 إلى 70 درجة مئوية؛ (ب) درجة حموضة مختلفة تتراوح من 1 إلى 10 لمدة 24 ساعة؛ (ج) تركيزات مختلفة من الإنزيم مع المذيبات العضوية (الميثانول، الإيثانول، الأيزوبروبانول، البيوتانول، الأسيتون)28؛ (د) تركيزات مختلفة من حلول الفاعل بالسطح [توين 80، توين 20، كبريتات دوديسيل الصوديوم (SDS)]29؛ و (E) أيونات المعادن المختلفة (CaCl2، NaCl، KCl، K4، NH4Cl، MgSo4، CuSo4، ZnSo4، EDTA)27. تحديد كفاءة الليباز بعد تحديد الحالة المثلى للإنزيم، تم اختبار المواد الطافية الواضحة، التي تحتوي على الليباز الفطري الخام، لكفاءتها في المنظفات (A)؛ (ب) إزالة بقع الزيت من الأقمشة؛ (ج) الدهون الحيوانية الطبيعية المهينة
منظف :
تم اختبار المواد الطافية الواضحة لكفاءتها باستخدام كل من المنظفات السائلة (Fairy، pandah، dac، lux، perial) والمسحوق (Tide، Arial، pandah، Persil، Omo) وفقًا لبروتوكول Bacha et al.30. باختصار، تم خلط المواد الطافية الصافية مع المنظفات السائلة و/أو المسحوقة بتركيزات 0.1% و1% (حجم:حجم أو وزن/حجم) لمدة 30 دقيقة عند 35 درجة مئوية. تم بعد ذلك تقييم نشاط الإنزيم من خلال مقياس الطيف الضوئي عند امتصاص 410 نانومتر. إزالة بقع الزيت :
تم أيضًا اختبار المواد الطافية الواضحة لكفاءتها في إزالة بقع الزيت من الأقمشة وفقًا لبروتوكول Das et al.31. باختصار، تم تقطيع قماش بولي قطن إلى قطع (3 سم ×   2 سم) وتم تلطيخ كل قطعة بقطرة من زيت السيارة أو السمك المقلي أو زيت الشوكولاتة. تم بعد ذلك ترك قطع القماش حتى تجف ووضعها في دورق سعة 100 مل مع أربع معالجات مختلفة. كانت المعالجات الأربعة هي: (أ) ماء (100 مل)، (ب) ماء مع منظف 1% (وزن/حجم) (99 مل  + 1 مل)، (ج) ماء مع الليباز (99 مل  + 1 مل)، ( د) ماء مع الليباز ومنظف (98 مل  + 1 مل  + 1 مل). تم إجراء كل علاج على نسختين، مرة واحدة بالماء البارد (25   ±   2 درجة مئوية) ومرة ​​بالماء الساخن (65   ±   2 درجة مئوية). تم تحضين جميع العلاجات وتحريكها بلطف لمدة 30 دقيقة. تمت بعد ذلك إزالة قطع القماش وتجفيفها وفحصها للتأكد من وجود بقايا الزيت. لتقدير كمية الأحماض الدهنية الحرة التي تم إطلاقها خلال كل علاج، تم استخدام مقايسة المعايرة بعد إجراء Dayanandan et
al.32.
تحلل الدهون الحيوانية الطبيعية :
تم اختبار المواد الطافية الواضحة لكفاءتها في تحطيم الدهون الحيوانية الطبيعية بعد بروتوكول Uppada et al.33. باختصار، تم تعقيم قطع دهون الدجاج والأغنام (2.5 جم) ووضعها في أنابيب قبل إضافة المواد الطافية الصافية. تم بعد ذلك تحضين الأنابيب عند درجة الحرارة المثلى (45 درجة مئوية و55 درجة مئوية على التوالي لـ A. niger MH078571.1 وA. niger MH079049.1) لمدة 24 و48 و72 و96 و120 و144 ساعة. بعد الحضانة، تم وزن قطع الدهون، وتم قياس نشاط الإنزيم بعد البروتوكول الوارد في Oliveira et al.25.
تحليل احصائي :
تم إجراء جميع التجارب في ثلاث نسخ (ن  =  3) واستخدمت القيم المتوسطة. تمثل العلامة ±   وأشرطة الخطأ الانحراف المعياري للمتوسط. لكل تجربة فردية، تم حساب ANOVA أحادي الاتجاه باستخدام برنامج SPSS 16.0. تم فحص الفروق الأقل أهمية (LSD) من خلال تحليل التباين (ANOVA) باستخدام برنامج SPSS الإصدار 2334.
الموافقة الأخلاقية :
لا تحتوي هذه المقالة على أي دراسات مع مشاركين بشريين أو حيوانات أجراها أي من المؤلفين.
نتائج :
مميزة للليباز تمت دراسة الظروف المثلى لنشاط الإنزيم وثباته (درجة الحرارة، الرقم الهيدروجيني، المذيبات العضوية، المواد الخافضة للتوتر السطحي، والأيونات المعدنية) لتحديد إمكانية استخدام الإنزيم. لذلك، تمت زراعة كلا العزلتين A. niger MH078571.1 و A. niger MH079049.1 تحت الظروف المثالية التالية للحصول على أعلى نشاط لليباز الفطري الخام: تأثير درجة الحرارة :
وبشكل عام فإن ارتفاع درجة الحرارة يؤدي إلى تسارع التفاعلات الكيميائية. ومع ذلك، يجب الأخذ في الاعتبار أن الإنزيمات عبارة عن بروتينات ويمكن أن تتلف بسبب الحرارة المرتفعة جدًا أو عند تعرضها للحرارة لفترة طويلة. يتمتع كل إنزيم بنطاق درجة حرارة مثالي حيث يؤدي أفضل أداء؛ والزيادة أو النقصان في نطاق درجة الحرارة المثالي هذا من شأنه أن يؤثر سلبًا على أداء هذا الإنزيم. كان أعلى نشاط لإنتاج الليباز بواسطة A. niger MH078571.1 عند 45 درجة مئوية، حيث تم الحصول على أعلى أداء لليباز بعد ساعة من الحضانة (794.23 وحدة / مل) (الجدول التكميلي S1). بعد 24 ساعة من الحضانة، فقد تأثير نشاط الليباز عند 45 درجة مئوية 16٪ فقط (الشكل التكميلي S1). ومع ذلك، بالنسبة لـ A. niger MH079049.1، كان أعلى نشاط لإنتاج الليباز عند 55 درجة مئوية، حيث تم الحصول على أعلى أداء لليباز بعد ساعة من الحضانة (796.92 وحدة / مل) (الجدول التكميلي S1). بعد 24 ساعة من الحضانة، فقدت فعالية نشاط الليباز عند 55 درجة مئوية 14٪ فقط (الشكل التكميلي S1).
تأثير الرقم الهيدروجيني :
يتمتع كل إنزيم بدرجة حموضة مثالية يصبح أكثر فعالية فيها؛ وانخفاض أو زيادة الرقم الهيدروجيني هذا من شأنه أن يؤثر سلبًا على أداء الإنزيم. كان الليباز أكثر فعالية واستقرارا عند درجة حموضة قلوية 8 لكلتا العزلتين. بعد ساعة من الحضانة، كان نشاط الليباز لـ A. niger MH078571.1 وA. niger MH079049.1 795.39 و795.77 وحدة/مل، على التوالي. (الجدول التكميلي S2). بعد 24 ساعة من الحضانة، فقدت سلالة A. niger MH078571.1 14٪ من نشاط الليباز عند درجة الحموضة 8 بينما فقدت سلالة A. niger MH079049.1 20٪ من نشاط الليباز عند نفس الرقم الهيدروجيني (الشكل التكميلي S2).
تأثير المذيبات العضوية :
للمذيبات العضوية دور كبير في التأثير على نشاط الإنزيمات وفعاليتها. تعتبر فعالية الإنزيم في وجود هذه المذيبات ضرورية وضرورية في العمليات الصناعية. وقد لوحظ أن أفضل مذيب للليباز هو الأسيتون، يليه الميثانول والبيوتانول بينما كان الأيزوبروبانول والإيثانول الأقل تنشيطاً للإنزيم. تم استخدام المذيبات العضوية بتركيزين مختلفين (50% و100%) لاختبار النشاط الأمثل للليباز لكلا العزلتين. أظهر تركيز المذيبات العضوية 50% نشاط إنزيمي أعلى. ومن المذيبات العضوية بلغت فعالية نشاط الليباز 96.5% للفطر A. niger MH078571.1 و 93% للنبات A. niger MH079049.1 في وجود الأسيتون بتركيز 50%. ومع ذلك، عند استخدام مذيب الأيزوبروبانول، كان نشاط إنزيم السلالتين هو الأقل فعالية (الجدول التكميلي S3؛ الشكل التكميلي S3).

تأثير المواد الخافضة للتوتر السطحي :
تم استخدام المواد الخافضة للتوتر السطحي بتركيزين مختلفين 0.1% و1% لاختبار نشاط الليباز الأمثل في كلا العزلتين. كان نشاط الليباز لكلتا العزلتين أفضل عند التركيز 0.1%. من بين المواد الخافضة للتوتر السطحي بلغت فعالية نشاط الليباز 103.42% لـ A. niger MH078571.1 و 112.4% لـ A. niger MH079049.1 في وجود توين 80 بتركيز 0.1%. ومع ذلك، كان نشاط الليباز في وجود SDS هو الأقل فعالية بتركيز 0.1٪ (الجدول التكميلي S4؛ الشكل التكميلي S4).
تأثير الأيونات :
ترتبط الأيونات بالإنزيمات وتنشطها. الأيونات المرتبطة بالإنزيم يمكن أن تحسن أو تمنع نشاط الإنزيم. ولهذا السبب تم استخدام ثمانية أيونات بتركيزين مختلفين (0.1% و 1%) لاختبار النشاط الأمثل للليباز لكلتا العزلتين. أظهر تركيز الأيونات 0.1% نشاط إنزيم أعلى. ومن بين الأيونات الثمانية بلغت فعالية نشاط الليباز 102% لعزلة A. niger MH078571.1 بوجود كل من كبريتات المنغنيز وكبريتات الزنك. بالنسبة لـ A. niger MH079049.1، قم بعزله. أظهر كلوريد الصوديوم بتركيز 0.1٪ أعلى نشاط لليباز بنسبة 105٪ (الجدول التكميلي S5؛ الشكل التكميلي S5).
تحديد درجة حرارة التخزين المثلى للليباز :
تم توضيح العلاقة بين نشاط الليباز ودرجة حرارة التخزين في الجدول التكميلي S6 والأشكال التكميلية S6. أفضل درجة حرارة تخزين لـ A. niger MH078571.1 كانت عند – 80 درجة مئوية، حيث حافظ الإنزيم على أكثر من 75.31% من نشاطه بعد أربعة أسابيع، بينما درجة 25 درجة مئوية هي الأقل كفاءة حيث فقد الإنزيم أكثر من 95% من نشاطه. نشاطه بعد أربعة أسابيع. في حالة A. niger MH.079049.1، حافظ الإنزيم على أكثر من 73.04% من نشاطه عند -80 درجة مئوية بعد 4 أسابيع. لقد فقد هذا الإنزيم حوالي 98٪ من فعاليته في نفس ظروف التخزين عند 25 درجة مئوية بعد أربعة أسابيع (الجدول التكميلي S6). تحديد كفاءة نشاط الليباز في مخلفات الزيوت الطبيعية :
يعد الزيت أحد العوامل الأساسية والأكثر أهمية في تحفيز إنتاج الإنزيم. ولذلك، تم استخدام أنواع مختلفة من بقايا النفط الموجودة في الطبيعة لكل من العزلتين A. niger MH078571.1 وA. niger MH.079049.1 (الجدول التكميلي S7). ورغم أن زيت قلي البطاطس كان له أعلى نشاط لليباز في الأيام الثلاثة الأولى من التجربة، إلا أن النتائج أظهرت أن الزيت المركب حافظ على نشاطه العالي خلال 15 يوما. الوحدة الأنزيمية في وجود زيت السمك لديها أقل نشاط بين الوحدات الأخرى.

كما تم اختبار أفضل وقت لإنتاج الإنزيم، وكان 3 أيام هو أعلى إنتاج للإنزيم في جميع أنواع الزيوت. تنخفض إنتاجية الإنزيم مع زيادة عدد الأيام.
تحديد كفاءة الليباز :
منظف :
تم استخدام العديد من المنظفات المسحوقة والسائلة بتركيزين مختلفين 0.1% و1% لاختبار النشاط الأمثل للليباز في A. niger MH078571.1 وA. niger MH.079049.1.

كان نشاط الليباز لكلتا العزلتين أفضل عند التركيز 1% مع مساحيق المنظفات. من بين المنظفات المسحوقة، وصلت فعالية نشاط الليباز إلى 91.07% لـ A. niger MH078571.1 مع 1% Omo و95.08% لـ A. niger MH.079049.1 مع 1% Persial (الجدول التكميلي S8).

في ظل وجود المنظفات السائلة، وصلت فعالية نشاط الليباز إلى 92.89٪ لـ A. niger MH078571.1 مع 0.1٪ Fairy و 97.54٪ لـ A. niger MH.079049.1 مع 1٪ لوكس (الجدول التكميلي S9؛ الأشكال التكميلية S7) -S8).

إزالة بقع الزيت :
لتحديد مدى فعالية الليباز في إزالة بقع الزيت من الأقمشة القطنية، تمت مقارنة أربع علاجات (الجدول 1 والشكل التكميلي S9). وقد لوحظ أن النشاط الإنزيمي لكلتا العزلتين كان أفضل عند درجات الحرارة المرتفعة (65 درجة مئوية) وأقل عند درجات الحرارة المنخفضة (25 درجة مئوية). تصبح فعالية الإنزيم في إزالة البقع عند 65 درجة مئوية أكثر وضوحًا عند ملاحظة الأرقام، حيث تمت إزالة أكثر من 80٪ من البقع عند معالجتها عند درجة حرارة عالية باستخدام الإنزيم والمنظف معًا (الشكل 1، الشكل التكميلي S10). ). في المقابل، عند درجة حرارة 65 درجة مئوية عند معالجة القماش القطني بمنظف وحده، تمت إزالة حوالي 45% فقط من بقع الزيت؛ وعند معالجتها بالإنزيم وحده، تمت إزالة ما يقرب من 50% من بقع الزيت. من بين أنواع الزيوت الثلاثة (زيت السيارة، زيت السمك، وزيت الشوكولاتة)، كان لزيت السمك أعلى نشاط إنزيمي لكلتا العزلتين في وجود المنظفات والإنزيم معًا عند درجة حرارة 65 درجة مئوية.
تحلل الدهون الحيوانية الطبيعية :
يمكن لإنزيم الليباز تحلل الدهون الثلاثية إلى أحماض دهنية وجلسرين. تم اعتماد قدرة الإنزيم هذه على تحليل الدهون الحيوانية (الدجاج والأغنام). تمكن إنزيم الليباز من عزلتين من تحليل أكثر من 90٪ من دهون الدجاج وأكثر من 85٪ من دهون الأغنام (الجداول 2، 3، الأشكال التكميلية S11، S12). كان نشاط الليباز مرتفعًا في الأيام الثلاثة الأولى، حيث تمت أكثر من نصف عملية التحلل.
مناقشة :
الليباز هو أحد المحفزات الحيوية الأساسية. ينفذ ردود الفعل في الوسط المائي وغير المائي. أنه يحفز التحلل المائي للدهون الثلاثية إلى الجلسرين والأحماض الدهنية. ونتيجة للخصائص الكيميائية والميكانيكية للليباز، تركزت الجهود عليه في مجال البحث العلمي والصناعي. توجد إنزيمات الليباز في معظم الكائنات الحية، مثل الحيوانات والنباتات والخمائر والفطريات والبكتيريا. اكتسبت إنزيمات الليباز الميكروبية اهتمامًا صناعيًا خاصًا نظرًا لقدرتها على الحفاظ على نشاطها تحت درجات الحرارة القصوى ودرجة الحموضة والمذيبات العضوية والظروف الكيميائية. يظهر الليباز الفطري كمصدر إنزيمي رئيسي بسبب نشاطه الحفاز، وانخفاض تكلفة الإنتاج، والسهولة النسبية في التلاعب الجيني.
العزلتان الأكثر إنتاجية للليباز في جنس Aspergillus هما A. niger MH078571.1 و A. niger MH079049.1. تم اختيار كلتا العزلتين لدراسة خصائصهما الفسيولوجية والكيميائية الحيوية وإمكانية تطبيقهما في التطبيقات الصناعية المختلفة (الشكل 2).

من الواضح أن تحمل الإنزيم لدرجات الحرارة المرتفعة واستقرار نشاطه مفيد في العمليات الصناعية. يساهم في رفع معدل التفاعل وإنتاجية العملية عن طريق زيادة ذوبان مواد ومنتجات التفاعل. كما أنه يزيح التوازن في التفاعلات الماصة للحرارة ويقلل التلوث البكتيري.
أظهرت النتائج أن درجة حرارة نشاط الإنزيم هي الأعلى والأكثر استقرارا بعد 24 ساعة من الحضانة وهي 45 درجة مئوية للإنزيم المنتج بواسطة A. niger MH078571.1 وعند 55 درجة مئوية للإنزيم المنتج بواسطة A. niger MH079049.1 . وهذا من شأنه أن يسمح بتنفيذ الإنزيم في مختلف الصناعات التجارية عند درجات حرارة عالية (