لخّصلي

Culture cellulaire..................CONSERVATION DES LIGNEES CELLULAIRES 3.1) Conservation par le froid Les cellules peuvent etre conservees en azote liquide (-196 ?C) pendant de longues periodes, a condition d'avoir ete correctement congelees et dans une solution cryoprotectrice appropriee (le DMSO) 3.2) Conservation sur milieu pauvre : c'est une conservation de courte duree (10 a 20 jours) realisee sur des milieux pauvre en serum et/ou en baissant la temperature de la culture a 20 ?C.16 METHODO EXPE IMMUNO (M2) 4.4) - Les milieux de culture On distingue 2 principaux types de milieux de culture : a) les milieux semi-synthetiques : composes d'un milieu de base (sels mineraux, glucose, acides amines, vitamines) tel que (BME : Eagle's Basal Medium, MEM : Eagle's Minimum Essential Medium, DMEM : Dulbecco Modified Eagle's Medium et le RPMI) et du serum (a 10%) ?le serum : le plus utilise est le serum de veau foetal (SVF) il optimise la survie et la croissance cellulaire en apportant les facteurs suivant : facteurs de croissance (FGF, les NGF, IGF, EGF les PDGF), proteines d'adhesion, proteines de transport, oligo-elements.oLe repiquage ou passage : Il s'agit cette fois de changer le milieu et le contenant, en transferant les cellules confluentes dans un contenant plus grand : d'abord elimination de l'ancien milieu par aspiration, lavage des cellules au PBS, decollement des cellules par trypsine-EDTA o ajout de milieu complet avec SVF : permet de remettre les cellules en suspension ; o numeration cellulaire : via le test de viabilite cellulaire (utilisant le bleu de trypan) afin de determiner la concentration cellulaire et d'additionner une quantite definie de cellules dans un volume defini de milieu, sur une surface definie.De repiquage en repiquage, les monocouches cellulaires sont lavees avec un tampon PBS puis traitees par une solution de trypsine- EDTA afin de rompre les liaisons proteiques intercellulaires et obtenir une suspension prete a etre ensemencees sur des milieux nutritifs neufs et avec une densite moindre a- Lignees cellulaires : * les lignees finies : qui se proliferent pendant un certains nombres de passages puis cessent de se diviser.Generalement, le tissu primaire est decoupe en fragments de 1 a 4 mm puis incorpores dans un flacon de culture contenant le milieu nutritif et apres jours, on observe une migration cellulaire a partir des differents fragments tissulaires puis une proliferation de ces dernieres.(Fig 2) Pour les tissus mous (thymus, rate,..), la methode mecanique est la plus adoptee elle effectuee par dilaceration des tissus primaires a l'aide d'une pipette ou encore par frottement du tissu sur une grille.Le mode d'obtention de ces cellules repond a deux methodes principales citant la mecanique et l'enzymatique Methodes d'obtention des cellules ?Methode de dissection mecanique (methode d'explant): c'est la plus ancienne, elle englobe differents protocoles (La methode de Carrel, La methode de Jensen et La methode de dissection sensu stricto) , ayant comme principe la migration des cellules a partir d'un explant (fragment).4.3) Equipement de la salle de culture : l'elaboration de cultures cellulaires necessite le materiel suivant : (Fig 4) a) Une hotte a flux laminaire : 14 METHODO EXPE IMMUNO (M2) steriles en generant un flux d'air purifie via un filtre HEPA (High Efficiency Particulate Air), afin d'eviter toute contamination de l'environnement, de l'utilisateur et/ou de la manipulation.11 METHODO EXPE IMMUNO (M2) Fig 1(A) : Culture stationnaire Fig 1(B) : Culture en suspension 2.3)- le stade de culture selon ce critere il existe trois principaux types de cultures : a- Cultures primaires ou primoculture : c'est l'inoculation aseptique de cellules provenant directement d'un organe ou d'un tissu.* les lignees continues : Ces lignees proliferent sans arret, et sont donc immortelles ; car elles ont perdu quelques maillons du controle du cycle cellulaire * les lignees transformees : Certaines lignees continues peuvent perdre leur propriete d'adherence et sont capables de donner des tumeurs lorsqu'elles sont injectees chez un animal.Elle consiste a utiliser des enzymes proteolytiques telles que la trypsine, la collagenase, la hyaluronidase pour digerer la trame proteique et permettant ainsi la liberation des cellules.Il en resulte une suspension de 12 METHODO EXPE IMMUNO (M2) cellules individuelles pretes a etre mises en primoculture.EVOLUTION D'UNE CULTURE CELLULAIRE (la Courbe de croissance) Elle est caracterisee par 3 temps : -La phase d'adaptation : c'est la phase de latence pendant laquelle la vitesse de croissance est nulle -La phase exponentielle : correspond a phase mitotique ou le un taux de croissance augmente jusqu'a devenir constant.APPLICATIONS DE LA CULTURE DES CELLULES ANIMALES physiologiques (recherche fondamentale ou appliquee) a Test de cytotoxicite en pharmacologie ou cosmetologie par exemple terferons, interleukines, facteurs de croissance, anticorps monoclonaux ...) appliquee) a Chirurgie reparatrice (peau, muscle, foie, vaisseaux sanguins, ....INTRODUCTION : Une culture de cellules est un bioprocede permettant de maintenir en dehors de l'organisme et dans des conditions physiologiques artificielles, des cellules non organisees en tissu mais 10 METHODO EXPE IMMUNO (M2) capable de se proliferer in vitro.Fig 1(A, B) a- Culture en monocouche ou stationnaire : dans ce type, les cellules se divisent jusqu'a former un tapis qui recouvre l'ensemble de la surface du support, ce stade est appele confluence.b- Culture en suspension : elle est realisee le plus souvent dans des flacons a agitation permanente afin d'eviter la decantation des cellules tels que : les flacons spinner (rotation magnetique) et les cytoculteurs .L'Equilibre du pH: Le pH du milieu et le pH intracellulaire sont des parametres cles controlant le bon fonctionnement metabolique, toute variation ou desequilibre de ces derniers peut engendrer de graves consequences sur le developpement et la survie cellulaires.L'ajout de ces substances varie en fonction des exigences du type cellulaire et de de l'objectif de la culture, on retrouve des hormones, facteurs de croissance, facteurs d'attachement, Antioxydants, les substances lipidiques et proteines de transport 5.NB: Il est important d'adapter la concentration des enzymes a la nature du tissu traite afin d'assurer une meilleure dissociation sans anomalies cellulaires ( trypsine :1 g de tissu pour 10 mL de solution). TYPES DE CULTURES CELLULAIRES Ils sont classes selon plusieurs criteres : 2.1) la morphologie cellulaire : Histologiquement on distingue : les cellules epitheliales, les cellules lymphoblastiques et les cellules fibroblastiques.C : flacons.1.2.?4.7.

Culture cellulaire……………… 1. INTRODUCTION : Une culture de cellules est un bioprocédé permettant de maintenir en dehors de l'organisme et dans des conditions physiologiques artificielles, des cellules non organisées en tissu mais
10
METHODO EXPE IMMUNO (M2)
capable de se proliférer in vitro. En conservant certaines caractéristiques spécifiques ; morphologiques et métaboliques Historiquement, trois évènements ont décrit le développement de la culture cellulaire. : - la culture des cellules nerveuses de grenouille dans un milieu lymphatique par Ross Harrison (1907). - la mise en culture des cellules de myocarde de poulet et l’élaboration des règles d’asepsie par Alexis Carrel (1912). - l'utilisation de la trypsine dans la séparation des cellules de leur trame par Moscona en 1952. Il la pratiquée sur un tissu d'oeuf de poulet afin d’obtenir des cellules capables de se diviser in-vitro. 2. TYPES DE CULTURES CELLULAIRES Ils sont classés selon plusieurs critères : 2.1) la morphologie cellulaire : Histologiquement on distingue : les cellules épithéliales, les cellules lymphoblastiques et les cellules fibroblastiques. 2.2) le comportement des cellules en culture Les cellules in vitro adaptent généralement deux aptitudes différentes suivant leurs natures physiologiques. Soit elles s’adhérent à un support (les cellules cohésives) c’est le système de culture en monocouche, soit elles flottent librement dans le milieu (cellules provenant du sang, lymphe, ascite, épanchement pleural) c’est le système de culture en suspension. Fig 1(A, B) a- Culture en monocouche ou stationnaire : dans ce type, les cellules se divisent jusqu’à former un tapis qui recouvre l’ensemble de la surface du support, ce stade est appelé confluence. Elle est realisée dans des boîtes, flacons ou en microplaques à fond plat. b- Culture en suspension : elle est réalisée le plus souvent dans des flacons à agitation permanente afin d’éviter la décantation des cellules tels que : les flacons spinner (rotation magnétique) et les cytoculteurs .
11
METHODO EXPE IMMUNO (M2)
Fig 1(A) : Culture stationnaire Fig 1(B) : Culture en suspension 2.3)- le stade de culture selon ce critère il existe trois principaux types de cultures : a- Cultures primaires ou primoculture : c’est l’inoculation aseptique de cellules provenant directement d’un organe ou d’un tissu. Le mode d’obtention de ces cellules répond à deux méthodes principales citant la mécanique et l’enzymatique Méthodes d’obtention des cellules ►Méthode de dissection mécanique (méthode d’explant): c‘est la plus ancienne, elle englobe différents protocoles (La méthode de Carrel, La méthode de Jensen et La méthode de dissection sensu stricto) , ayant comme principe la migration des cellules à partir d’un explant (fragment). Généralement, le tissu primaire est découpé en fragments de 1 à 4 mm puis incorporés dans un flacon de culture contenant le milieu nutritif et après jours, on observe une migration cellulaire à partir des différents fragments tissulaires puis une prolifération de ces dernières.(Fig 2) Pour les tissus mous (thymus, rate,..), la méthode mécanique est la plus adoptée elle effectuée par dilacération des tissus primaires à l'aide d'une pipette ou encore par frottement du tissu sur une grille. ►Méthode de digestion enzymatique : C’est la plus pratiquée. Elle consiste à utiliser des enzymes protéolytiques telles que la trypsine, la collagénase, la hyaluronidase pour digérer la trame protéique et permettant ainsi la libération des cellules.Il en résulte une suspension de
12
METHODO EXPE IMMUNO (M2)
cellules individuelles prêtes à être mises en primoculture. NB: Il est important d’adapter la concentration des enzymes à la nature du tissu traité afin d’assurer une meilleure dissociation sans anomalies cellulaires ( trypsine :1 g de tissu pour 10 mL de solution). ► La culture d’une suspension cellulaire. L’obtention de ces cellules est plus facile à réaliser que celle du tissu solide. Elles sont prélevées à partir d’un échantillon liquidien puis séparées par centrifugation différentielle (technique des gradients de Ficoll). b-Cultures secondaires :elle fait suite à la culture primaire. Lorsque les cellules de cette dernière se divisent et recouvrent la totalité de la surface du support, elles deviennent confluentes et s’arrêtent de pousser (l'épuisement des éléments nutritifs, l'accumulation des métabolites et l’inhibition de contact). De ce fait, elles nécessitent un passage dans un autre récipient, c’est ce qu’on appelle un repiquage. De repiquage en repiquage, les monocouches cellulaires sont lavées avec un tampon PBS puis traitées par une solution de trypsine- EDTA afin de rompre les liaisons protéiques intercellulaires et obtenir une suspension prête à être ensemencées sur des milieux nutritifs neufs et avec une densité moindre a- Lignées cellulaires : * les lignées finies : qui se prolifèrent pendant un certains nombres de passages puis cessent de se diviser. Ils sont sensibles au phénomène de sénescence cellulaire qui se manifeste par une apoptose des cellules. * les lignées continues : Ces lignées prolifèrent sans arrêt, et sont donc immortelles ; car elles ont perdu quelques maillons du contrôle du cycle cellulaire * les lignées transformées : Certaines lignées continues peuvent perdre leur propriété d’adhérence et sont capables de donner des tumeurs lorsqu’elles sont injectées chez un animal. Elles sont dites des lignées transformées ou des lignées de cellules cancéreuses 3. EVOLUTION D’UNE CULTURE CELLULAIRE (la Courbe de croissance) Elle est caractérisée par 3 temps : -La phase d'adaptation : c’est la phase de latence pendant laquelle la vitesse de croissance est nulle -La phase exponentielle : correspond à phase mitotique où le un taux de croissance augmente jusqu’à devenir constant.
13
METHODO EXPE IMMUNO (M2)
C’est une enceinte permettant la manipulation des cultures cellulaires dans des conditions
-La phase stationnaire. Déterminée par un plateau traduisant l’arrêt de la croissance ; lignée définie : mort cellulaire, lignée indéfinie : croissance continue (pas d’inhibition de contact) Fig 3 : Courbe de croissance des cellules en culture (Freshney, 2005). 4. CONDITIONS DE CULTURE DES CELLULES ANIMALES 4.1). Notion de la stérilité Tout protocole faisant appel à la culture cellulaire exige un milieu stérile, c’est-à-dire un milieu dépourvu de tout organisme vivant. Ceci inclus la stérilisation des surfaces, du matériel et des réactifs principalement les milieux de culture. 4.2) Conditions physicochimiques : on distingue ; la température (37°c), le pH, l’Oxygène (les cellules animales sont aérobies strictes) et l’Osmolarité (afin de prévenir l’augmentation de l’osmolarité du milieu due à l’évaporation). 4.3) Equipement de la salle de culture : l’élaboration de cultures cellulaires nécessite le matériel suivant : (Fig 4) a) Une hotte à flux laminaire :
14
METHODO EXPE IMMUNO (M2)
stériles en générant un flux d’air purifié via un filtre HEPA (High Efficiency Particulate Air), afin d’éviter toute contamination de l’environnement, de l’utilisateur et/ou de la manipulation. Il en existe 2 types : hotte à flux laminaire verticale et hotte à flux laminaire horizontale b) Un incubateur à CO2 : c’est une enceinte thermostatée (T=37 °C), équipé d'une arrivée de CO2 (5 %) et d'un bac d'eau (humidité à 98 %.). L’Équilibre du pH: Le pH du milieu et le pH intracellulaire sont des paramètres clés contrôlant le bon fonctionnement métabolique, toute variation ou déséquilibre de ces derniers peut engendrer de graves conséquences sur le développement et la survie cellulaires. Généralement, on utilise le système tampon (HCO3-/CO2) ; le bicarbonate de sodium ((NaHCO3-) est en solution dans le milieu de culture et il est en équilibre avec un pourcentage de 5 % en CO2 dans l'atmosphère ambiante de culture. Le pKa de ce système tampon est de 6,3. CO2 + H2O HCO3- + H+ L’utilisation d’un indicateur coloré tel que le rouge de phénol révèle à tout moment le pH de la suspension et par conséquent l'état de la culture. RQ : Le rouge de phénol -pH 7 : coloration rouge orangé. - pH basique : Une coloration rouge violacée - pH acide : Une coloration jaune. c) Autre appareillage : les microscopes inversé et optique, la centrifugeuse, du matériel et des instruments spécifiques à la manipulation cellulaire : verrerie stérile, flacon de culture, boîte de Pétri, pipettes et pipeteurs stériles…
15
METHODO EXPE IMMUNO (M2)
B
A
C
D
E
F
G
FIG 4 : A : Incubateur à CO2 . B : Hotte à flux laminaire. C : flacons. D :bioreacteurs, E : boites petri. F : spinner, G : compteur cellulaire automatique ,Plaque micropuits.
16
METHODO EXPE IMMUNO (M2)
4.4) - Les milieux de culture On distingue 2 principaux types de milieux de culture : a) les milieux semi-synthétiques : composés d’un milieu de base (sels minéraux, glucose, acides aminés, vitamines) tel que (BME : Eagle’s Basal Medium, MEM : Eagle’s Minimum Essential Medium, DMEM : Dulbecco Modified Eagle's Medium et le RPMI) et du sérum (à 10%) ●le sérum : le plus utilisé est le sérum de veau foetal (SVF) il optimise la survie et la croissance cellulaire en apportant les facteurs suivant : facteurs de croissance (FGF, les NGF, IGF, EGF les PDGF), protéines d'adhésion, protéines de transport, oligo-éléments. De plus Il contient des inhibiteurs de protéases (inactive la trypsine utilisées lors de repiquage) et il protège les cellules lors de l’agitation. Quel que soit le type du milieu la présence des antibiotiques (pénicilline, streptomycine), des antifongiques, du rouge phénol et du tampon est obligatoire. b) Les milieux définis : ils sont formés par des constituants quantifiées additionnés à un milieu synthétique de base riche (type HAM F12 ou MCDB 104). L'ajout de ces substances varie en fonction des exigences du type cellulaire et de de l'objectif de la culture, on retrouve des hormones, facteurs de croissance, facteurs d’attachement, Antioxydants, les substances lipidiques et protéines de transport 5. Entretien de la culture cellulaire • Le changement de milieu : pour les cellules adhérentes non encore confluentes, on peut se contenter de changer le milieu appauvri par du milieu neuf : les cellules continuent de se multiplier. •Le repiquage ou passage : Il s’agit cette fois de changer le milieu et le contenant, en transférant les cellules confluentes dans un contenant plus grand : d’abord élimination de l’ancien milieu par aspiration, lavage des cellules au PBS, décollement des cellules par trypsine-EDTA • ajout de milieu complet avec SVF : permet de remettre les cellules en suspension ; • numération cellulaire : via le test de viabilité cellulaire (utilisant le bleu de trypan) afin de déterminer la concentration cellulaire et d’additionner une quantité définie de cellules dans un volume défini de milieu, sur une surface définie.
17
METHODO EXPE IMMUNO (M2)
6. CONSERVATION DES LIGNEES CELLULAIRES 3.1) Conservation par le froid Les cellules peuvent être conservées en azote liquide (–196 °C) pendant de longues périodes, à condition d’avoir été correctement congelées et dans une solution cryoprotectrice appropriée (le DMSO) 3.2) Conservation sur milieu pauvre : c’est une conservation de courte durée (10 à 20 jours) réalisée sur des milieux pauvre en sérum et/ou en baissant la température de la culture à 20 °C. Ainsi, la survie cellulaire est maintenue mais à un rythme très ralenti. 7. APPLICATIONS DE LA CULTURE DES CELLULES ANIMALES physiologiques (recherche fondamentale ou appliquée) à Test de cytotoxicité en pharmacologie ou cosmétologie par exemple terférons, interleukines, facteurs de croissance, anticorps monoclonaux …) appliquée) à Chirurgie réparatrice (peau, muscle, foie, vaisseaux sanguins, …. et peut-être un jour neurones)