لخّصلي

اتبعت الدراسة إرشادات أخلاقية صارمة وبروتوكولات سلامة لضمان المعاملة الإنسانية وتقليل أي مخاطر محتملة مرتبطة بالتعرض للإشعاع. في اليوم العشرين من الحمل، باستخدام طريقة معتمدة توفر نتيجة سريعة وخالية من الألم. تم وزن كل فأر بعناية لتسجيل وزنه النهائي قبل الشروع في التشريح. تم استخراج كل جنين بعناية، والإجراءات، 000 دورة في الدقيقة لمدة دقيقة واحدة قبل التخلص من السائل المتدفق. 5 ميكرولتر من كل من البرايمرات الأمامية والخلفية (20 بيكومول) لتضخيم الجين المستهدف. تم تحديد نسبة التعبير النسبي باستخدام المعادلة: نسبة التعبير النسبي = 2^(-ΔΔCt) المعادلة 1 حيث تم حساب ΔΔCt على النحو التالي: ΔΔCt = (〖Ct〗(الجين المستهدف)- 〖Ct〗(الجين المرجعي) )(العينة المعالجة) - (〖Ct〗التحكم- 〖Ct〗المعالجة )(عينة التحكم) المعادلة 2 تم حساب قيم ΔCt لكل من الجين المستهدف والجين المرجعي على النحو التالي: 〖ΔCt〗(الجين المستهدف)= (〖Ct〗(الجين المستهدف، المعالج)- 〖Ct〗(الجين المستهدف، المعالج) - 〖Ct〗(جين المرجع، اختيار الأنسجة للفحص النسيجي المرضي للتقييم النسيجي المرضي، تم استخدام عينات أنسجة أجنة الفئران المحفوظة بالفورمالين. تجفيف الأنسجة تم تنفيذ هذه الخطوة على مرحلتين:

2.1. اقتناء الحيوانات، ظروف الإيواء والاعتبارات الأخلاقية:

لإجراء هذا التجربة، تم اختيار عشرين فأرة بيضاء عذراء وفأر ذكر خصب (سلالة BALB/c)، كل منها يزن بين 40-53 جرام. تم الحصول على هذه الفئران من معهد تيودور بلهارس للأبحاث (TBRI)، الواقع في شارع النيل، إمبابة ورق الحضر، الجيزة، وهو مؤسسة مرموقة معروفة بتوفير حيوانات مختبرية عالية الجودة للأبحاث الطبية الحيوية. عند وصولها، تم نقل الفئران بعناية إلى المختبر وإيواؤها في بيئة خاضعة للرقابة مصممة لتقليل التوتر وضمان رفاهيتها.
استمرت فترة التكيف لمدة أسبوع قبل بدء التجربة. خلال هذه الفترة، كانت الفئران تعيش في أقفاص بولي بروبيلين قياسية مع فراش ناعم، تُنظف بانتظام للحفاظ على النظافة. تم تنظيم الظروف البيئية بعناية، حيث تم الحفاظ على نطاق درجة حرارة يتراوح بين 25-30 درجة مئوية ورطوبة نسبية تبلغ حوالي 50-60%، مما يضمن موئلاً مستقراً ومريحاً. تم تزويد الفئران بإمكانية الوصول الحر إلى نظام غذائي متوازن من الحبيبات التجارية والماء العذب لتلبية احتياجاتها الغذائية.
لمراقبة تكيفهم مع البيئة الجديدة، تم مراقبة الفئران يوميًا بحثًا عن أي علامات على الضيق أو المرض أو السلوك غير الطبيعي. شمل ذلك تقييم حالتهم الصحية العامة، مستويات نشاطهم، حالة فرائهم، ووزنهم. تم تسجيل أي علامات على الإجهاد أو المرض وإدارتها وفقًا لذلك لضمان بقاء جميع الحيوانات في حالة مثالية قبل البدء في التجربة.
بعد الانتهاء من مرحلة التكيف، تم اعتبار الفئران التي تتراوح أعمارها بين 8-9 أسابيع مناسبة للتكاثر. تم إجراء هذه الدراسة بدقة وفقًا للإرشادات الأخلاقية ولوائح رفاهية الحيوانات. تمت مراجعة واعتماد البروتوكولات التجريبية من قبل لجنة رعاية واستخدام الحيوانات بجامعة بنها (ZD/FSc/BU-IACUC/2024-24)، كلية العلوم، قسم علم الحيوان. تم تنفيذ جميع الإجراءات وفقًا للمعايير الأخلاقية المؤسسية والدولية لعلاج الحيوانات التجريبية بطريقة إنسانية.
2.2. إجراء التزاوج

تم بدء عملية التزاوج بوضع ثلاثة إناث من الفئران العذراء في قفص واحد مع ذكر بالغ خصب طوال الليل للسماح بالتزاوج الطبيعي. تم اختيار هذه الاستراتيجية الجماعية لتعظيم نجاح التزاوج مع تقليل التوتر بين الحيوانات. في صباح اليوم التالي، تم فحص وجود سدادة مهبلية في كل أنثى. اكتشاف هذا السدادة، وهو إفراز متخثر يتكون أثناء التزاوج، كان بمثابة مؤشر موثوق على نجاح التزاوج واستخدم لتحديد اليوم الأول من الحمل (Balshy et al., 2020). في غياب سدادة المهبل، تم جمع قطرة من السائل المهبلي واختبارها للكشف عن وجود الحيوانات المنوية، وهو ما فُسر على أنه دليل على التزاوج. الإناث التي لم تظهر سدادة مهبلية أُعيدت إلى قفص التكاثر لمحاولة تزاوج أخرى في الليلة التالية.
بمجرد تأكيد التزاوج، تم فصل الإناث الحوامل بعناية وإيواؤهن بشكل فردي في أقفاص نظيفة ومهوّاة جيدًا. كان السكن الفردي ضروريًا لتقليل العوامل المجهدة المحتملة، وتقليل المنافسة على الموارد، وتوفير بيئة مثالية للحمل. خلال هذه الفترة، تم الحفاظ على الفئران في ظروف بيئية محكومة، مع درجة حرارة مستقرة (25-30 درجة مئوية)، ودورة ضوئية مظلمة متسقة (12:12 ساعة)، والوصول المستمر إلى نظام غذائي تجاري غني بالمغذيات وماء عذب لدعم احتياجاتها الأيضية المتزايدة.
خلال فترة الحمل، تم مراقبة الإناث عن كثب لرصد التغيرات الفسيولوجية والسلوكية التي تشير إلى الحمل الطبيعي. شملت التقييمات اليومية تتبع زيادة الوزن والشهية. تم توثيق أي انحرافات عن التقدم المتوقع للحمل ومعالجتها لضمان صحة الأم ونجاح نتائج الحمل.
2.3. المجموعات التجريبية والتعرض للإشعاع

تم تعيين الإناث الحوامل عشوائيًا إلى واحدة من أربع مجموعات لتقييم تأثيرات الإشعاع الجاما بجرعات متفاوتة. لم تتعرض مجموعة التحكم (المجموعة أ) لأي إشعاع وكانت بمثابة خط الأساس للمقارنة. تم تخصيص المجموعات الثلاث المتبقية كمجموعات تجريبية، حيث تم تعريض كل منها لمستويات مختلفة من الإشعاع الجاما. تعرضت المجموعة ب لجرعة إشعاعية مقدارها 5 ملغراي، والمجموعة ج لجرعة مقدارها 10 ملغراي، والمجموعة د لجرعة مقدارها 50 ملغراي. مصدر الإشعاع المستخدم للتعرض كان السيزيوم-137، الذي ينبعث منه إشعاع جاما بمستوى طاقة يبلغ 662 كيلو إلكترون فولت. تمت إجراءات الإشعاع في هيئة الطاقة الذرية المصرية، وهي منشأة مجهزة بأنظمة توصيل إشعاعي دقيقة لضمان التعرض المنضبط والمتساوي.
خلال عملية الإشعاع، بقيت الفئران الحوامل في أقفاصها المنزلية لتقليل التوتر الناتج عن التعامل ومنع التغيرات الفسيولوجية غير الضرورية التي قد تؤثر على نتائج التجربة. تم إعطاء الإشعاع بمعدل جرعة اسمي قدره 10 ملغاي/دقيقة، مع تعديل فترات التعرض وفقًا لكل مجموعة: 30 ثانية للمجموعة ب (5 ملغاي)، دقيقة واحدة للمجموعة ج (10 ملغاي)، و5 دقائق للمجموعة د (50 ملغاي). لتوحيد الظروف، تم حجب الطعام والماء مؤقتًا خلال فترة الإشعاع للقضاء على المتغيرات المربكة المحتملة التي قد تنشأ من اختلافات في النشاط الأيضي.
تم إجراء عملية الإشعاع في اليوم الخامس عشر من الحمل، وهو نافذة تطورية حاسمة تم اختيارها بناءً على دراسات سابقة (Davidson et al., 2020 و Nemec-Bakk et al., 2021). تشير الأبحاث إلى أن التعرض للإشعاع المؤين خلال الثلث الثالث من حمل الفئران (الذي يمتد عادةً من اليوم الخامس عشر إلى اليوم التاسع عشر من الحمل) يمكن أن يؤدي إلى تغييرات فسيولوجية وتطورية كبيرة في النسل. تتوافق هذه النقطة الزمنية مع مرحلة حاسمة من تكون الجهاز العصبي للأجنة وتكوين الأعضاء، مما يجعلها ذات أهمية خاصة لدراسة تأثيرات التعرض للإشعاع قبل الولادة.
بعد التعرض للإشعاع، أُعيدت الإناث الحوامل إلى ظروف سكنهن الخاصة، حيث تم مراقبتهن عن كثب لأي آثار فورية بعد التعرض، مثل التغيرات السلوكية، أو علامات الضيق، أو التغيرات في مستويات التغذية والنشاط. اتبعت الدراسة إرشادات أخلاقية صارمة وبروتوكولات سلامة لضمان المعاملة الإنسانية وتقليل أي مخاطر محتملة مرتبطة بالتعرض للإشعاع.
2.4. المراقبة بعد الإشعاع والتشريح

في اليوم العشرين من الحمل، تم euthanize الفئران الحوامل بطريقة إنسانية لتسهيل جمع البيانات الجنينية والأمومية. تمت عملية القتل الرحيم وفقًا للإرشادات الأخلاقية لضمان الحد الأدنى من الضيق للحيوانات، باستخدام طريقة معتمدة توفر نتيجة سريعة وخالية من الألم. بعد إجراء القتل الرحيم، تم وزن كل فأر بعناية لتسجيل وزنه النهائي قبل الشروع في التشريح.
تم تشريح الأرحام بدقة تحت ظروف معقمة لمنع التلوث وضمان القياسات الدقيقة. تم تسجيل عدد الأجنة المزروعة، والامتصاصات، وأي تشوهات مرئية لتقييم التأثيرات المحتملة للإشعاع على الأجنة. تم استخراج كل جنين بعناية، وتجفيفه لإزالة السائل الأمنيوسي الزائد، ووزنه فورًا باستخدام ميزان رقمي عالي الدقة. بالإضافة إلى ذلك، تم قياس طول جسم الجنين باستخدام مسطرة لتقييم القيود المحتملة على النمو المرتبطة بمستويات مختلفة من التعرض للإشعاع.
لتسهيل التحليل المقارن، يتم تمثيل التصميم التجريبي بصريًا في الشكل 6، الذي يوضح مجموعات الإشعاع، والإجراءات، والجدول الزمني للدراسة. تم تقديم صور تمثيلية للأجنة المشروحة في الشكل 7، مما يبرز أي اختلافات ملحوظة في مورفولوجيا الأجنة بين المجموعات الضابطة والتجريبية. توفر هذه البيانات مجتمعة رؤى حول تأثير الإشعاع الجاما قبل الولادة على تطور الجنين، مما يسمح بتقييم شامل للتأثيرات المعتمدة على الجرعة.
٢.٥. استخراج RNA
تمت إزالة عينات من أنسجة الكبد weighing approximately 30 mg بعناية من كل جنين ووضعها فورًا في أنابيب مغلقة بسعة 2 مل ومعقمة لضمان سلامة العينة. لحفظ استقرار RNA ومنع تحلله، تم معالجة جميع العينات على الثلج والتعامل معها باستخدام معدات خالية من RNase. تم إجراء استخراج RNA باستخدام مجموعة RNeasy Mini Kit (Qiagen، الرقم المرجعي 74104)، وفقًا للبروتوكول القياسي للشركة المصنعة لضمان الحصول على عائد ونقاء عاليين من RNA للتحليلات الجزيئية اللاحقة.
لبدء عملية الاستخراج، تم تجانس كل عينة كبد في 600 ميكرولتر من محلول RLT، وهو محلول تحلل مضاف إليه 10 ميكرولتر من β-Mercaptoethanol (Sigma-Aldrich) لكل مل من المحلول. تم تضمين β-Mercaptoethanol كعامل مختزل لتفكيك الروابط الثنائية الكبريت في البروتينات وتعزيز حفظ RNA عن طريق تعطيل RNases. تمت عملية تجانس العينة باستخدام جهاز TissueLyser (Qiagen) بسرعة 30 هرتز لمدة دقيقتين، مما يضمن تكسيرًا شاملاً لنسيج الكبد وتحللًا خلويًا فعالًا.
بعد التماثل، تم تعريض المستخلصات للطرد المركزي بسرعة 14,000 دورة في الدقيقة لمدة 3 دقائق لإزالة الحطام الخلوي. تم نقل الطور العلوي الصافي الناتج بعناية إلى أنبوب جديد خالٍ من إنزيم RNase. تمت إضافة حجم متساوٍ من الإيثانول 70% وتم الخلط فورًا باستخدام الماصة، مما يضمن ترسيب الحمض النووي الريبي بشكل صحيح وارتباطه بالغشاء القائم على السيليكا في أعمدة الطرد المركزي. ثم تم تطبيق العينات على أعمدة الطرد المركزي RNeasy في خطوات تحميل متعددة لاستيعاب الحجم الزائد، حيث تم طرد كل جزء عند 14,000 دورة في الدقيقة لمدة دقيقة واحدة قبل التخلص من السائل المتدفق.
لإزالة الملوثات، تم غسل RNA المرتبط بشكل متتابع باستخدام 700 ميكرولتر من محلول RW1 (لإزالة الملوثات البروتينية والحمض النووي) و500 ميكرولتر من محلول RPE (لإزالة الأملاح والشوائب المتبقية)، وفقًا لمعايير الطرد المركزي الخاصة بالشركة المصنعة. تم إجراء غسلة ثانية باستخدام محلول RPE، مع خطوة طرد مركزي نهائية تستمر لمدة دقيقتين لضمان إزالة الإيثانول بالكامل. ثم تم استبعاد RNA المنقى في 50 ميكرولتر من الماء الخالي من RNase، تلاه الطرد المركزي بسرعة 10,000 دورة في الدقيقة لمدة دقيقة واحدة، مما أسفر عن RNA عالي الجودة مناسب للتطبيقات اللاحقة.
2.6. تحضير مزيج PCR الرئيسي

تم تحويل RNA المستخرج إلى DNA تكميلي (cDNA) باستخدام إنزيم النسخ العكسي RevertAid (Thermo Fisher، رقم الكاتالوج EP0441)، وفقًا لتعليمات الشركة المصنعة. كانت خطوة النسخ العكسي هذه ضرورية لتحويل RNA إلى شكل مستقر وقابل للتضخيم مناسب للتحليل اللاحق بتفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي (qPCR).
لكل تفاعل qPCR، تم تحضير مزيج رئيسي باستخدام مجموعة Quantitect SYBR Green PCR (Qiagen، الرقم المرجعي 204141)، والتي تحتوي على جميع المكونات اللازمة للتضخيم الفعال والدقيق. تم تحضير خليط التفاعل بحجم إجمالي قدره 25 ميكرولتر، يتكون من 12.5 ميكرولتر من 2x SYBR Green PCR Master Mix، الذي يوفر بوليميراز الحمض النووي الريبي منقوص الأكسجين، وdNTPs، وصبغة SYBR Green للكشف القائم على الفلورية. بالإضافة إلى ذلك، تم تضمين 0.25 ميكرولتر من النسخ العكسي لتسهيل تخليق cDNA. لضمان التخصصية، تم إضافة 0.5 ميكرولتر من كل من البرايمرات الأمامية والخلفية (20 بيكومول) لتضخيم الجين المستهدف. تم تعديل الحجم النهائي باستخدام 8.25 ميكرولتر من الماء الخالي من RNase، وتم استخدام 3 ميكرولتر من RNA القالب كمادة ابتدائية لكل تفاعل.
البرايمرات المستخدمة في التضخيم تم تصميمها خصيصًا لاستهداف β-actin وP53 وBAX، والتي يتم تحليلها عادةً في دراسات التعبير الجيني. تمت تخليق هذه البرايمرات والحصول عليها من شركة Metabion (ألمانيا)، وهي مورد موثوق به للنوكليوتيدات عالية الجودة. شمل β-actin كجين مرجعي سمح بتطبيع مستويات التعبير الجيني، بينما تم اختيار P53 وBAX لصلتهما بالأهداف التجريبية.
2.7. تسلسلات البرايمر

تم اختيار تسلسلات البرايمر المستخدمة في تحليل التعبير الجيني في هذه الدراسة بناءً على الأبحاث السابقة. تم تصميم هذه البرايمرات لتضخيم الجينات المستهدفة P53 وBAX وβ-actin (جين housekeeping) بشكل محدد لتقييم مستويات التعبير النسبي لها.
كانت تسلسلات البرايمر لجين P53 كما يلي (Tohidi et al., 2015):
• البرايمر الأمامي: 5'-GTATTTCACCCTCAAGATCC-3'
• البرايمر العكسي: 5'-TGGGCATCCTTTAACTCTA-3'
بالنسبة لجين BAX، كانت تسلسلات البرايمر (Jalili et al., 2017):
• البرايمر الأمامي: 5'-CTCAAGGCCCTGTGCACTAA-3'
• البرايمر العكسي: 5'-GAGGCCTTCCCAGCCAC-3'
تم تضخيم الجين المنزلي β-actin، المستخدم كتحكم داخلي للتطبيع، باستخدام البرايمرات التالية (Sisto et al., 2003):
• البادئ الأمامي: 5'-CTCAAGGCCCTGTGCACTAA-3'
• البادئ العكسي: 5'-GAGGCCTTCCCAGCCAC-3'
تم الحصول على تسلسلات البرايمر هذه من دراسات منشورة سابقًا وتم تصنيعها بواسطة Metabion (ألمانيا). اختيار β-actin كجين مرجعي سمح بالتطبيع الدقيق لبيانات التعبير الجيني، مما يضمن القياس الموثوق لمستويات التعبير عن P53 وBAX في العينات التجريبية. 
2.8. شروط تفاعل البوليميراز المتسلسل في الوقت الحقيقي

تم إجراء تضخيم PCR باستخدام نظام Stratagene MX3005P PCR في الوقت الحقيقي، الذي يتميز بخمسة مجموعات فلاتر مختارة ونظام مسح بصري متقدم لفصل الصبغات بدقة وكشف الفلورسنت. مكن هذا النظام من المراقبة الفورية لتكبير الحمض النووي باستخدام SYBR Green، مما يضمن قياسًا دقيقًا لمستويات التعبير الجيني.
ظروف الدورة الحرارية للبيتا-أكتين، P53، وBAX اتبعت بروتوكولًا موحدًا، بما في ذلك خطوة النسخ العكسي الأولية عند 50 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة، تليها خطوة الت denaturation الأولية عند 94 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة. تمت عملية التضخيم على مدى 40 دورة، مع ضبط درجات حرارة التهجين الخاصة بالجنس عند 55 درجة مئوية للبيتا-أكتين و60 درجة مئوية لبروتين P53 وBAX، مما يضمن ارتباطًا مثاليًا للبرايمر والخصوصية. تم إجراء تحليل منحنى التفكك في نهاية التفاعل للتحقق من خصوصية المنتجات المضخمة واكتشاف أي تضخيم غير محدد محتمل أو تكوين ثنائي البادئات. تم تقديم ظروف الدورة التفصيلية لتفاعل البلمرة المتسلسل في الوقت الحقيقي باستخدام صبغة SYBR Green في الجدول 1.
تحليل بيانات PCR

تم تحديد منحنيات التضخيم وقيم Ct (عتبة الدورة) باستخدام برنامج MX3005P. تم استخدام طريقة ΔCt لتطبيع التعبير الجيني إلى β-actin، الجين المنزلي، مما يضمن مقارنات دقيقة عبر العينات. تم حساب مستويات التعبير الجيني النسبي بعد ذلك باستخدام طريقة 2-ΔΔCt، وفقًا للنهج الذي وصفه يوان وآخرون (2006).
تم تحديد نسبة التعبير النسبي باستخدام المعادلة:

نسبة التعبير النسبي = 2^(-ΔΔCt) المعادلة 1
حيث تم حساب ΔΔCt على النحو التالي:

ΔΔCt = (〖Ct〗(الجين المستهدف)- 〖Ct〗(الجين المرجعي) )_(العينة المعالجة) - (〖Ct〗_التحكم- 〖Ct〗المعالجة )(عينة التحكم) المعادلة 2

تم حساب قيم ΔCt لكل من الجين المستهدف والجين المرجعي على النحو التالي:

〖ΔCt〗(الجين المستهدف)= (〖Ct〗(الجين المستهدف، المعالج)- 〖Ct〗_(الجين المستهدف، الضابط) ) المعادلة 3

〖ΔCt〗(جين المرجع) = (〖Ct〗(جين المرجع، المعالج) - 〖Ct〗_(جين المرجع، التحكم) ) المعادلة 4

توفر طريقة 2-ΔΔCt تقديرًا نسبيًا لتغيرات التعبير الجيني، حيث تشير القيم التي تزيد عن 1 إلى زيادة التعبير، وتشير القيم التي تقل عن 1 إلى انخفاض التعبير للجين المستهدف مقارنةً بمجموعة التحكم. تمثل قيم التغير النسبي الناتجة حجم الفرق في التعبير الجيني، مما يسمح بتفسير بيولوجي دقيق.
المعالجة النسيجية وفحص الرئتين والقلب والكبد

اختيار الأنسجة للفحص النسيجي المرضي

للتقييم النسيجي المرضي، تم استخدام عينات أنسجة أجنة الفئران المحفوظة بالفورمالين. تم اختيار الرئتين والقلب والكبد بسبب أهميتها الفسيولوجية واحتمالية تعرضها للتلف الناتج عن الإشعاع. تمت معالجة الأنسجة باستخدام جهاز معالجة الأنسجة الآلي، وفقًا للتقنيات النسيجية القياسية. 
تثبيت الأنسجة

تم غمر الأنسجة في الفورمالين المخفف بنسبة 10% لمدة 48 ساعة لضمان التثبيت المناسب والحفاظ على الشكل الخلوي. تثبيت الفورمالين يمنع التحلل الذاتي والتدهور الميكروبي عن طريق ربط البروتينات ببعضها البعض، مما يحافظ على سلامة بنية الأنسجة. بعد التثبيت، تم شطف العينات في الماء المقطر لمدة 30 دقيقة لإزالة المثبت المتبقي وتقليل عيوب التلوين.
تجفيف الأنسجة

تمت عملية التجفيف باستخدام سلسلة متدرجة من محاليل الكحول لإزالة محتوى الماء تدريجياً مع الحفاظ على الهياكل الخلوية. تضمن البروتوكول:
70% إيثانول لمدة 120 دقيقة.
90% إيثانول لمدة 90 دقيقة.
الإيثانول المطلق (100%) لدورتين كل منهما 60 دقيقة
تضمن عملية التجفيف التدريجي الحفاظ على سلامة الأنسجة قبل التبييض والتسلل بالشمع.
تطهير الأنسجة

بعد التجفيف، تم تطهير الأنسجة باستخدام الزيلين لاستبدال الإيثانول وتعزيز اختراق البارافين. تم تنفيذ هذه الخطوة على مرحلتين:
I. خليط بنسبة 50:50 من الإيثانول والزيلين لمدة 60 دقيقة
II. زيلين نقي لمدة 90 دقيقة إضافية
تم استخدام الزيلين بسبب فعاليته في إزالة الكحول المتبقي وزيادة معامل الانكسار للأنسجة، مما يهيئها للتضمين في البارافين.
تضمين البارافين

تم تشبع الأنسجة المصفاة بالشمع البارافيني المنصهر عند درجة حرارة 58-60 درجة مئوية، مما يضمن التسلل الكامل. ثم تم تضمين العينات في كتل من الشمع البرافيني، والتي سمح لها بالتصلب في درجة حرارة الغرفة. التمديد الصحيح يضمن أن الأنسجة تبقى محفوظة بشكل جيد وموجهة بشكل صحيح للتقطيع.
المجهرية والتقطيع

بمجرد أن تتصلب، تم تقسيم كتل البارافين إلى شرائح رقيقة (بسمك 4-5 ميكرومتر) باستخدام الميكروتوم. تم تثبيت الشرائح بعناية على شرائح زجاجية لضمان الحفاظ على الهيكل قبل الصبغ.
صبغة الهيماتوكسيلين والإيوزين (H&E)

تمت معالجة مقاطع الأنسجة بصبغة الهيماتوكسيلين والإيوزين (H&E)، وفقًا للبروتوكول الموصوف من قبل سوفارنا وآخرون (2018). تُميز هذه الطريقة في الصبغ الهياكل الخلوية وتعزز التباين للتقييم المجهري.
يصطبغ الهيماتوكسيلين النوى باللون الأزرق الداكن، مما يسمح برؤية مورفولوجيا النواة وهياكل الكروماتين.
يصطبغ الإيوسين السيتوبلازم والمصفوفة خارج الخلوية باللون الوردي، مما يوفر تباينًا لتقييم أفضل لهيكل الأنسجة.
الفحص المجهري والتحليل النسيجي المرضي

تم فحص المقاطع الملونة تحت المجهر الضوئي لتقييم التغيرات الهيستوباثولوجية في أنسجة الرئة والقلب والكبد. ركز التحليل على اكتشاف:
الاضطرابات الدورية (مثل الاحتقان الوعائي، الوذمة، النزيف)
الاستجابات الالتهابية (مثل: تسرب الكريات البيضاء، تورم الأنسجة)
التنكس الخلوي (مثل: تكوّن الفجوات السيتوبلازمية، فقدان سلامة الخلايا)
التغيرات المبرمجة للخلايا والتغيرات النخرية (مثل التكثف النووي، تفتت الكروماتين، تمزق الغشاء)
الفحص النسيجي المرضي الخاص بالأعضاء

الرئتين: شمل التحليل المجهري تقييم الهياكل القصبية الهوائية، والتسلل الالتهابي، وانهيار الحويصلات الهوائية، والبرامج المبرمج للموت الخلوي.
القلب: تم فحص المقاطع للتحقق من سلامة خلايا عضلة القلب، والتليف بين الأنسجة، والأضرار الميتوكوندرية، والتغيرات الالتهابية في أنسجة عضلة القلب.
الكبد: كانت التقييمات تركز على تنكس الخلايا الكبدية، توسع الجيوب الكبدية، التهاب البوابة، والاستماتة أو التنخر الناتج عن الإشعاع.
كان الهدف من التحليل النسيجي المرضي هو ربط مستويات التعرض للإشعاع بالتغيرات الخلوية والأنسجة الملحوظة في كل عضو تم فحصه.
التحليل الإحصائي

تم إجراء التحليل الإحصائي باستخدام برنامج SPSS (الإصدار 20، IBM Corp.، أرمنك، نيويورك، الولايات المتحدة الأمريكية). تم التعبير عن البيانات كمتوسط ± الخطأ المعياري للمتوسط (SEM). تم استخدام اختبار كروسكال-واليس H، وهو طريقة غير معلمية، لتقييم الفروق الإحصائية بين مجموعات مستقلة متعددة. عندما تم اكتشاف فروق ذات دلالة إحصائية، تم تطبيق اختبار دان بعد الاختبار للمقارنات الزوجية المتعددة لتحديد أي المجموعات المحددة تختلف بشكل كبير (Corder & Foreman, 2009 و Field, 2013).