Lakhasly

Cette étude a développé une nouvelle méthode HPLC hors ligne utilisant des radicaux AAPH pour le criblage antioxydant de 20 composés polyphénoliques, dont l'efficacité a été évaluée par le test TEAC. Comparée aux méthodes ABTS et DPPH, la méthode AAPH s'est avérée plus sensible. Appliquée à un extrait de Lepechinia meyenii, elle a permis d'identifier sept antioxydants connus : acide caféique, hespéridine, acide rosmarinique, diosmine, rosmarinate de méthyle, diosmétine et rosmarinate de n-butyle. L'optimisation des conditions de génération des radicaux AAPH (température, temps, concentration) a été réalisée en utilisant la consommation de Trolox comme mesure quantitative. L'analyse HPLC a été effectuée sur une colonne Eclipse XDB-C18, et la réduction de la surface des pics, calculée par des formules spécifiques, a permis d'identifier les composés présentant une activité antioxydante. Les méthodes ABTS et DPPH ont également été utilisées pour comparaison.

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Aliments. 16 mars 2023 ; 12(6) : 1258. doi : 10.3390/foods12061258
Criblage et évaluation de composés actifs dans des mélanges de polyphénols par une nouvelle méthode HPLC hors ligne AAPH et son application
Zhaoyang Wu 1 , Guanglei Zuo 2, 3 , Soo-Kyeong Lee 1, 4 , Sung-Mo Kang 1 , Sang-Youn Lee 5 , Saba Noreen 1 , Soon-Sung Lim 1, 4, *
Editeurs : Guendalina Graffigna , Luigi Lucini
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Informations sur le droit d'auteur et la licence
PMCID : PMC10048677 PMID : 36981186
Abstrait
Dans cette étude, nous avons développé une nouvelle méthode de chromatographie liquide haute performance (HPLC) hors ligne basée sur les radicaux dichlorhydrate de 2,2'-azobis(2-amidinopropane) (AAPH) pour le criblage antioxydant dans 20 composés polyphénoliques et avons utilisé le test de capacité antioxydante équivalent Trolox pour évaluer leur activité antioxydante. Français Comparée aux méthodes HPLC hors ligne existantes basées sur l'acide 2,2'-azino-bis(3-éthylbenzothiazoline-6-sulfonique (ABTS) et le 2,2-diphényl-1-picrylhydrazyl (DPPH), la méthode HPLC hors ligne basée sur le radical AAPH est plus sensible. De plus, nous avons appliqué cette méthode à l' extrait de Lepechinia meyenii (Walp.) Epling et avons éliminé sept antioxydants, l'acide caféique, l'hespéridine, l'acide rosmarinique, la diosmine, le rosmarinate de méthyle, la diosmétine et le rosmarinate de n-butyle, qui sont des antioxydants connus. Par conséquent, cette étude fournit de nouvelles perspectives sur le criblage des antioxydants dans les extraits naturels.

Mots-clés : polyphénols, HPLC hors ligne, AAPH, Lepechinia meyenii (Walp.) Epling

1. Introduction
   Français Ces dernières années, l'incidence des maladies chroniques telles que le diabète, l'obésité, les maladies cardiovasculaires et cérébrovasculaires et le cancer a augmenté chaque année, entraînant une lourde charge de morbidité [ 1 ]. De plus en plus de preuves soutiennent le rôle crucial que joue le stress oxydatif dans le développement de lésions tissulaires, conduisant à une gamme de pathologies, toutes caractérisées par un changement de l'état oxydatif [ 2 ]. Le stress oxydatif fait référence à une condition dans laquelle les composants de la membrane cellulaire, tels que les protéines, les acides nucléiques et les lipides, sont endommagés par des oxydants par des moyens non enzymatiques [ 3 ]. Par conséquent, les antioxydants peuvent agir comme des facteurs clés contre le stress oxydatif pour réduire l'incidence des maladies chroniques.

Français En effet, de nombreuses études précliniques et cliniques indiquent que les produits de peroxydation lipidique jouent un rôle dans plusieurs pathologies, notamment l'inflammation, l'athérosclérose, le diabète, le vieillissement, les maladies neurodégénératives et le cancer [ 4 ]. Le dichlorhydrate de 2,2′-azobis(2-amidinopropane) (AAPH) est bien connu pour induire fortement la peroxydation lipidique chez les membres, entraînant une réduction de la viabilité et une régulation positive de la génération d'espèces réactives de l'oxygène [ 5 , 6 ]. Actuellement, la méthode de criblage hors ligne la plus largement utilisée pour les antioxydants est basée sur l'acide 2,2'-azino-bis(3-éthylbenzothiazoline-6-sulfonique (ABTS) et les radicaux 2,2-diphényl-1-picrylhydrazyle (DPPH), et à l'heure actuelle, il n'existe pas de méthode de criblage hors ligne basée sur les radicaux liés à la peroxydation lipidique. Le mode de transfert d'électrons des radicaux DPPH et ABTS est le transfert d'électron unique, tandis que le mode de transfert d'électrons des radicaux AAPH est le transfert d'atomes d'hydrogène [ 7 ]. Sur la base des différents modèles de transfert d'électrons, les composés criblés à partir de produits naturels sont également différents. Par conséquent, il est nécessaire de développer une méthode hors ligne basée sur les radicaux AAPH pour cribler les antioxydants afin de retarder les dommages cellulaires causés par les produits de peroxydation lipidique.

Français Les composés phénoliques sont une classe relativement importante de composés parmi les nombreux métabolites secondaires des plantes. Il fait référence à une classe de composés formés en remplaçant les atomes d'hydrogène sur les cycles benzéniques dans les hydrocarbures aromatiques par des groupes hydroxyles. Plus de 8000 polyphénols ont été identifiés, qui peuvent être classés en trois groupes principaux [ 8 , 9 , 10 ]. Les flavonoïdes sont un groupe de métabolites secondaires polyphénoliques présents dans les plantes, avec C6-C3-C6 comme structure de base, et comprennent la quercétine, la catéchine, la taxifoline et l'apigénine [ 11 ]. Les acides phénoliques sont un groupe de composés constitués d'un cycle phénolique et d'une fonction acide carboxylique organique (squelette C6-C1), y compris les acides hydroxybenzoïques (acide gallique) et les acides hydroxycinnamiques (acide caféique). Les stilbènes sont un groupe de composés naturels caractérisés par la présence d'une structure centrale de trans-stilbène, constituée de deux cycles phényles liés par une double liaison, et le composé typique est le resvératrol [ 12 ].

Français Les produits naturels sont une source importante d'antioxydants, en particulier les plantes médicinales. Lepechinia meyenii (Walp.) Epling ( L. meyenii ), un membre de la famille des Lamiacées , est originaire d'Argentine, de Bolivie et du Pérou, et son infusion à base de plantes est couramment utilisée au Pérou comme médecine traditionnelle pour traiter diverses affections, notamment le diabète, la toux, l'inflammation, la diarrhée, les spasmes, les maux d'estomac et les douleurs articulaires et gastriques [ 13 ]. Dans notre étude précédente, l'extrait de L. meyenii s'est avéré avoir une bonne activité antioxydante, et sept composants principaux ont été isolés et identifiés à partir de cet extrait ; cependant, leur activité anti-peroxydation lipidique était inconnue, ce qui nous a incité à utiliser la HPLC hors ligne pour clarifier davantage l'activité anti-peroxydation lipidique et la composition de L. meyenii [ 14 ].

Dans cette étude, nous avons développé une nouvelle méthode de chromatographie liquide haute performance (HPLC) hors ligne basée sur les radicaux AAPH pour le criblage antioxydant de 20 composés polyphénoliques et avons utilisé le test de capacité antioxydante équivalente Trolox pour évaluer leur activité antioxydante. La méthode développée a ensuite été appliquée à L. meyenii , et les résultats obtenus ont été comparés à ceux obtenus par les méthodes HPLC hors ligne DPPH et ABTS existantes.

2. Matériels et méthodes
   2.1. Réactifs et plantes
   2,2′-azobis (2-amidinopropane) dichlorhydrate (AAPH), 2,2′-azino-bis(3-éthylbenzothiazoline-6-acide sulfonique (ABTS), 2,2-diphényl-1-picrylhydrazyl (DPPH), apigénine, acide caféique, (+)-catéchine, acide p-coumarique, 3,4-dihydroxy-L-phénylalanine, acide 2,5-dihydroxybenzoïque, acide 3,4-dihydroxybenzoïque, acide 2,4-dihydroxycinnamique, acide 3,4-dihydroxyhydrocinnamique, acide formique, acide gallique, acide 4-hydroxyphénylacétique, acide 2-hydroxycinnamique, 4,4′-méthylènediphénol, chlorure de potassium, persulfate de potassium, phosphate de potassium monobasique, quercétine, resvératrol, acide rosmarinique, acide sinapique, L'acide syringique, l'hydrogénophosphate de sodium, le chlorure de sodium, la taxifoline et le Trolox ont été achetés auprès de Sigma-Aldrich Chemical Co. (St. Louis, MO, États-Unis). Le méthanol a été acheté auprès de JT Baker Co. (Phillipsburg, NJ, États-Unis) pour la préparation et l'analyse des échantillons. L'eau ultrapure utilisée dans cette étude a été produite à l'aide d'un système de purification d'eau Milli-Q (Millipore Co., Bedford, MA, États-Unis).

Les parties aériennes de L. meyenii ont été récoltées à Lima en 2015 et vérifiées par Paul H. Gonzales Arce (PHGA). Les échantillons séchés (L-2015-A30), l'extrait (L-2015-A30E) et les composés séparés (L-2015-A30C1-7) ont été déposés au Centre d'évaluation de l'efficacité et du développement des aliments et médicaments fonctionnels de l'Université Hallym.

2.2. Préparation d'un étalon unique, d'étalons mixtes et d'un extrait de L. meyenii
Français Tout d'abord, 20 types de solutions de méthanol de 50 mmol d'étalons de polyphénols ont été préparés et conservés à 4 °C dans l'obscurité pour des expériences ultérieures. Ensuite, en utilisant le même volume, les 20 solutions étalons ont été mélangées pour préparer une solution étalon mixte de 2,5 mmol, qui a été diluée à 320 µmol dans du méthanol et conservée à −20 °C dans l'obscurité pour une utilisation ultérieure. L' extrait de L. meyenii et les composés actifs isolés de celui-ci utilisés dans cette étude ont été obtenus à partir de recherches antérieures, préparés sous forme de méthanol à 1 mg/mL, et conservés à −20 °C dans l'obscurité pour une utilisation ultérieure [ 14 ].

2.3. Optimisation des conditions de génération de radicaux AAPH
Français Les radicaux AAPH ont été générés dans des conditions de chauffage. Dans cette étude, nous avons étudié les effets de la température du bain-marie (65, 70, 75, 80, 85 °C), du temps de chauffage (20, 30, 40, 50, 60 min) et de la concentration d'AAPH (500, 750, 1000, 1250 et 1500 µmol dans du PBS ; pH = 7,4) sur la production de radicaux AAPH en utilisant une expérience à facteur unique, et la consommation de Trolox a été utilisée comme étalon quantitatif. Tout en examinant d'autres facteurs, cette étude a utilisé 75 °C, 30 min et 500 µmol pour contrôler les variables. La teneur en Trolox a été quantifiée à l'aide d'une courbe d'étalonnage (50-500 µmol) et détectée à 291 nm à l'aide d'un spectrophotomètre UV (UV1601, SHIMADZU, Kyoto, Japon) [ 15 ].

2.4. Analyse HPLC
Le mélange étalon a été analysé à l'aide d'un équipement Agilent Technologies (Santa Clara, CA, États-Unis). Le dispositif comprenait une pompe G1311A, un injecteur d'échantillons automatisé G1329A, un four à colonne G1316A maintenu à 30 °C et un détecteur G1314D. Les phases mobiles HPLC utilisées étaient de l'eau acide (0,1 % d'acide formique ; A) et du méthanol (B). Les mélanges étalons ont été analysés à 254 nm et séparés à un débit de 0,7 ml/min à l'aide d'une colonne Eclipse XDB-C18 (250 × 4,6 mm, 5 µm). Le processus de séparation était le suivant : 10 % de B de 0 à 5 min, 10 à 50 % de B de 5 à 40 min, 50 à 100 % de B de 40 à 55 min et 100 % de B de 55 à 60 min. Les échantillons de L. meyenii ont également été analysés à 254 nm et séparés avec un débit de 0,7 mL/min à l'aide d'une colonne Eclipse XDB-C18 (250 × 4,6 mm, 5 µm), le processus de séparation étant de 10 à 100 % B à 0 à 20 min et de 100 % B à 20 à 26 min [ 13 ].

2.5. Criblage d'antioxydants à partir de standards mixtes et d'extraits à l'aide de la chromatographie liquide haute performance hors ligne AAPH
En bref, un mélange de 300 µL de solution d'AAPH (16 mmol dans du PBS à pH 7,4) et de 300 µL de solution étalon mixte (320 µmol dans du méthanol) ou d'extrait (1 mg/mL dans du méthanol) a été incubé pendant 50 min à 65, 75 et 85 °C. Par conséquent, la solution réactionnelle avec un volume d'injection de 10 µL a été analysée par HPLC. Comme blanc, la solution d'AAPH a été remplacée par du PBS lors de l'incubation avec les étalons mixtes ou l'extrait pour former un groupe sans AAPH. Comparés au groupe sans AAPH, les composés présentant des aires de pic réduites dans le groupe AAPH ont été considérés comme ayant une activité antioxydante potentielle. De plus, afin d'étudier l'effet de la température de chauffage sur les polyphénols, nous avons mis en place un groupe, un mélange de 300 µL de PBS et de 300 µL de solution étalon mixte ou d'extrait sans chauffage, comme groupe témoin. La réduction de la surface du pic par chauffage et par radicaux AAPH a été calculée respectivement selon les formules (1) et (2) suivantes :

Réduction maximale par chauffage = (Un témoin − Un groupe libre AAPH )/Un témoin × 100 % (1)
Réduction maximale par les radicaux AAPH = (A groupe libre AAPH − A groupe AAPH )/A groupe libre AAPH × 100 % (2)
2.6. Criblage d'antioxydants à partir de standards mixtes et d'extraits à l'aide de la chromatographie liquide haute performance (HPLC) hors ligne ABTS
Français La solution de radical ABTS (ABTS + ) a été préparée en mélangeant 11 mg d'ABTS, 9,5 mg de persulfate de potassium et 300 mL d'eau distillée. La solution de travail d'ABTS a été préparée à l'obscurité par incubation pendant 16 h à 25 °C. Brièvement, 200 µL de solution de travail d'ABTS préparée précédemment et 20 µL de la solution étalon mixte (320 µmol dans le méthanol) ou de l'extrait (1 mg/mL dans le méthanol) ont été mélangés et incubés pendant 6 min à 25 °C dans l'obscurité. Par conséquent, la solution réactionnelle, avec un volume d'injection de 10 µL, a été analysée par HPLC. Comme blanc, la solution d'ABTS a été remplacée par de l'eau lors de l'incubation avec les étalons mixtes ou l'extrait pour former un groupe libre ABTS + . Comparés au groupe libre ABTS + , les composés avec des surfaces de pic réduites dans le groupe ABTS + ont été considérés comme ayant une activité antioxydante potentielle [ 16 ]. La réduction de la surface du pic par les radicaux ABTS a été calculée à l'aide de la formule suivante (3) :

Réduction du pic par les radicaux ABTS = (A groupe libre ABTS − A groupe ABTS )/A groupe libre ABTS × 100 % (3)
2.7. Criblage d'antioxydants à partir de standards mixtes et d'extraits par HPLC hors ligne DPPH
En bref, 150 µL de solution de DPPH (2,5 mg/mL dans le méthanol) et 50 µL de la solution étalon mixte (320 µmol dans le méthanol) ou de l'extrait (1 mg/mL dans le méthanol) ont été mélangés et incubés pendant 30 minutes à 37 °C. La solution réactionnelle, injectée dans un volume de 10 µL, a ensuite été analysée par CLHP. À titre de contrôle, la solution de DPPH a été remplacée par du méthanol lors de l'incubation avec les étalons mixtes ou l'extrait afin de former un groupe sans DPPH. Comparés à ce groupe, les composés présentant une surface de pic réduite dans le groupe DPPH ont été considérés comme ayant une activité antioxydante potentielle [ 16 ]. La réduction de la surface de pic par les radicaux DPPH a été calculée à l'aide de la formule (4) suivante :

Réduction maximale des radicaux DPPH = (Un groupe libre DPPH − Un groupe DPPH )/Un groupe libre DPPH × 100 % (4)
2.8. Dosage de la capacité antioxydante équivalente au Trolox (TEAC)
La solution ABTS + a été préparée comme indiqué dans la partie 2.6. Dix microlitres d'échantillon (0,5 mmol dans du méthanol) ont été ajoutés à une plaque à 96 puits contenant 290 μl de solution ABTS + et incubés à l'obscurité pendant 10 minutes à 25 °C. La détection a été effectuée par un lecteur de microplaques EL800 (Bio-Tek Instruments, Winooski, VT, États-Unis) à une absorbance de 750 nm. Les résultats standard sont exprimés en équivalents Trolox µmol [ 17 Résultats et discussion
3.1. Optimisation des conditions de génération de radicaux AAPH
Comme le montre la figure 1 , la température du bain-marie, le temps de chauffage et la concentration en AAPH étaient des facteurs clés affectant la génération de radicaux AAPH. Avec l'augmentation de la température du bain-marie, la prolongation du temps de chauffage, l'augmentation de la concentration en AAPH et la consommation de Trolox ont augmenté, ce qui a représenté une augmentation de la génération de radicaux AAPH. Par conséquent, un temps de chauffage de 50 minutes était approprié. Lorsque la concentration en Trolox était de 500 µmol, une concentration en AAPH de 1250 µmol était suffisante. Comme la concentration de chaque étalon dans les polyphénols mixtes était de 320 µmol, selon la conversion d'échelle, 16 mmol d'AAPH ont été utilisés pour cribler les antioxydants des polyphénols mixtes en vue d'expériences ultérieures.
Donner moi le résumé de la méthode de détection les polyphenols